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猪传染性胃肠炎病毒S蛋白在昆虫细胞中的表达及间接ELISA抗体诊断方法的建立

李菁

   猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病。现已成为猪的一种世界性疾病,给养猪业造成极大危害。该病临床症状和流行病学与猪流行性腹泻(PED)、猪轮状病毒(PRV)、猪呼吸道冠状病毒(PRC)均十分类似,因此确诊必须借助实验室诊断。 在TGEV的结构蛋白中,S蛋白是唯一能在动物体内诱导产生中和抗体的主要结构蛋白。S蛋白又可包括A、B、C、D四个主要抗原位点,不同分离株的TGEVS蛋白A、B和D位点高度保守,其中,A、D位点是主要诱导中和抗体产生的抗原位点。因此,S蛋白不仅是研究TGEV基因工程疫苗的主要目的基因,而且对于该病的诊断具有重要意义。本研究的目的是把S基因5’端包含A、D抗原位点的一段序列(TS1)克隆入杆状病毒表达载体系统中,转染昆虫细胞,获得体外表达的TS1蛋白,并将该蛋白作为诊断抗原建立间接ELISA抗体诊断方法。 本研究根据GenBank数据库中的TGEV基因序列(NC002306)设计了一对引物,针对S基因5’端包含A、D抗原位点的1077bp的序列(TS1),并含有EcoRⅠ、和SalⅠ酶切位点。用RT-PCR技术从国内分离的TGEV HN株中获得大小为1077bp的PCR产物,将其克隆至pMD18-T载体,转化DH5a,然后在LB平板上挑取阳性菌落,37℃过夜培养,提取质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定,结果显示扩增片段与预期片段大小相符;序列测定结果表明,克隆的TS1蛋白基因完全符合载体阅读框,扩增的TS1基因与TGEV HN株核苷酸序列符合率100%,氨基酸序列符合率100%。将质粒与穿梭载体pFastBac1分别进行双酶切,经回收后连接。连接产物转化DH5a,得到重组转移质粒pFastBac1-TS1,提取阳性克隆质粒转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的受体菌E.coliDH10Bac中,发生转座作用,在含庆大霉素,卡那霉素,四环素3种抗生素和X-gal/IPTG的LB培养板上,筛选出白色菌落得到重组穿梭载体Bacmid-TS1,用高分子量质粒提取法提取质粒,经PCR鉴定为阳性后,采用阳离子脂质体法转染到Sf9昆虫细胞,于27℃培养5天后出现细胞病变,收获病毒。空斑筛选后得到纯化的重组病毒rAcV-Bac-TS1,经RT-PCR、IFA、SDS-PAGE和Western-blotting鉴定TS1基因的转录和表达,结果表明重组杆状病毒TS1蛋白(约43KD)在Sf9昆虫细胞中得到表达。 在上述工作的基础上,以重组杆状病毒TS1蛋白为诊断抗原,经条件优化,建立了监测TGEV血清抗体水平的间接ELISA方法.用该方法检测了240份血清样品,结果表明:本试验建立的间接ELISA诊断方法具有良好的敏感性和特异性,为免疫猪群抗体监测和TGE流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法.……   
[关键词]:TGEV S蛋白;杆状病毒表达系统;间接ELISA;诊断
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2007年