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补益药藏波罗花(I.younghusbandii Sprague)抗氧化抗衰老活性物质的分离纯化、结构鉴定和药理研究

潘为高

   本文系统地研究了藏波罗花的几种提取物体内外抗氧化、抗衰老活性,分离纯化出了两种高效活性物质,并进行了活性物质的结构鉴定和解析;通过对活性物质的药理研究,初步探索了藏波罗花抗氧化、抗衰老的机理。本研究揭示了藏波罗花抗氧化抗衰老的物质基础,有利于藏波罗花药用价值的深度开发和利用。 藏波罗花的五种提取物分别为:根的干粉用80%乙醇提取,浓缩干燥得IYS1,得率36.8%;80%乙醇提取过后的残渣,再用水提取,浓缩干燥得IYS2,得率16.9%;根的干粉直接用水提取,浓缩干燥得IYS3,得率49.7%;将IYS1用80%乙醇配制成0.5mg/ml浓度溶液,加适量的乙酸乙酯,发生沉淀,上层浓缩干燥得IYS4,得率7.73%,下层浓缩干燥得IYS5,得率29.0%。 利用三个离体指标测定五种提取物的体外抗氧化活性,发现体外活性强弱顺序依次为IYS4>IYS1>IYS3>IYS5>IYS2。选用活性最强的IYS4作为分离纯化的样品,经正相硅胶柱层析、反相C18柱层析、反相半制备型高效液相,首次从藏波罗花中分离到两个具有优良抗氧化活性的化合物A和B。通过低分辨ESI-MS得出化合物A和B的分子量均为624,进一步通过高分辨HRESI-MS得出它们的分子式均为C_(29)H_(36)O_(15)。通过1D-NMR(~1H NMR,~(13)C NMR,DEPT)和2D-NMR(~1H-~1H COSY,HSQC,HMBC,NOESY和TOCSY)解析两个化合物的结构;并进行了化合物A和B水解单糖硅烷化衍生物的GC-MS鉴定,得出化合物A和B的甲基五碳糖均为L-鼠李糖,六碳糖均为D-葡萄糖。化合物A的结构最后鉴定为β-D-Glucopyranoside,2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl3-0-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-,4-[(2E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propenoate](9CI).。化合物B的结构最后鉴定为:β-D-Glucopyranoside,2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl-3-0-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-,6-[(2E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propenoate](9CI).。通过与CA库中所有具有C_(29)H_(36)O_(15)这一分子式,并且结构相似的化合物进行对比,化合物B为一个新的化合物。化合物A和B是两个同分异构体,具有完全相同的分子式C_(29)H_(36)O_(15)。它们的~1H NMR,~(13)C NMR,DEPT,~1H-~1H COSY,HSQC,HMBC,NOESY和TOCSY谱也极其相似。化合物A和B的UV/PDA谱基本相同,均在198nm和330nm处具有强吸收。在相同色谱条件下,化合物B要比A的保留时间长。化合物A和B分别均含有多个酚羟基,这可能是它们具有抗氧化活性的结构根源。化合物A首次报道存在于藏波罗花根中(43.1mg/g),是一个具有多种生物活性、用途广泛的化合物。 分别利用纯品A和B作外标,采用分析型HPLC测定五种提取物中的这两种化合物的含量,并由IYS1中的含量推断藏波罗花干根中化合物A和B的含量。结果如下:化合物A含量的高低次序为IYS4(380.6mg/g)>IYS1(113.6mg/g)>IYS3(40.4mg/g)>IYS5(28.7mg/g)>IYS2(7.5mg/g);化合物B含量的高低次序为IYS4(76.1mg/g)>IYS1(18.9mg/g)>IYS3(5.1mg/g)>IYS5(3.2mg/g)>IYS2(0.7mg/g);化合物A+B总含量的高低次序为IYS4(456.7mg/g)>IYS1(132.5mg/g)>IYS3(45.5mg/g)>IYS5(31.9mg/g)>IYS2(8.2mg/g)。藏波罗花干根中,化合物A和B分别为43.1mg/g和7.1mg/g,可见A的含量远高于化合物B的含量。 利用Folin-Ciocalteu试剂法,测定五种提取物中多酚含量,结果如下:多酚含量的高低次序为IYS4(154.85±2.73mg/g)>IYS1(47.94±0.76 mg/g)>IYS3(26.18±0.76mg/g)>IYS5(20.88±0.76 mg/g)>IYS2(12.21±1.00mg/g)。化合物A和B的多酚含量分别为388.68±0.56mg/g和353.24±3.55mg/g。 五种提取物中多酚含量的高低顺序与化合物A含量高低顺序、化合物B含量高低顺序、化合物A和B的总含量高低顺序完全一致,表明多酚含量与化合物A、B或A和B的总含量成绝对正相关关系。 采用L16_4_5正交表进行正交工艺设计,研究藏波罗花的最佳提取工艺条件。结果:从得率×多酚极差来看,溶剂用量对得率×多酚影响最大(672.354),其他几个因素影响其次。以得率×多酚作为实验结果进行分析,从效应曲线图可见,最佳工艺条件为:温度60℃,时间为6小时,溶剂浓度为50—65%乙醇,溶剂用量为9—12倍(W/V),搅拌速度400rpm。 采用超氧阴离子(O_2~(·-))清除实验、羟自由基HFR(~·OH)的清除实验和小鼠肝组织过氧化脂质(LPO)抑制实验进行五种提取物和化合物A和B的体外抗氧化活性测定。超氧阴离子(O_2~(·-))清除活性:化合物A(49.3%)>化合物B(45.4%)>Vc(34.5%)>IYS4(16.0%)>IYS1(5.9%)>IYS3(1.8%)>IYS2(0.9%)>IYS5(0.6%)。羟自由基HFR(~·OH)清除活性:苯甲酸(345min)>化合物A(330min)=化合物B(330min)>IYS4(300min)>IYS1(120min)=Vc(120min)>IYS3(90min)>IYS5(60min)>IYS2(60min)>空白(15min)。小鼠肝组织过氧化脂质(LPO)抑制活性:化合物A(-97.2%)=化合物B(-97.1%)≈IYS4(-97.4%)≈IYS1(-96.1%)>IYS3(-92.2%)≈IYS5(-90.6%)>BHT(-57.6%)≈IYS2(-53.8%)>Vc(206.3%)。 提取物中多酚含量、化合物A和B总含量越高,超氧阴离子(O_2~(·-))和羟自由基HFR(~·OH)的清除能力越强,反之,清除能力越弱;二者完全成正相关关系。Vc的超氧阴离子(O_2~(·-))清除能力、羟自由基HFR(~·OH)的清除能力要比化合物A或B差。醇提物(IYS1)或醇提物的极性较弱部分(IYS4)要比亲水性的提取物(IYS2、IYS3、IYS5)清除超氧阴离子(O_2~(·-))、羟自由基HFR(~·OH)的能力强。Vc有强烈的促LPO生成的作用。只要微量的化合物A或B,就能强烈保护肝组织免受氧化作用,这是其它药物(例如BHT、Vc)所无法比拟的。藏波罗花醇提物抗氧化性能优于水提物,醇提物能明显保护肝组织免受氧化作用。化合物A和B高浓度(1.0000 mg/ml)和低浓度(0.0625 mg/ml)对小鼠肝组织过氧化脂质(LPO)抑制率较低;而中浓度(0.2500 mg/ml)抑制率最高。 IYS2、IYS3、IYS5的多酚含量和化合物A和B总含量低,对雌雄果蝇寿命延长作用不明显;IYS1和IYS4多酚含量和化合物A和B总含量高,对雌雄果蝇寿命具有非常明显的延长作用。表明多酚含量及化合物A和B的总含量与果蝇延寿率成正相关。有效成分(多酚含量、化合物A和B总含量)达到一定剂量后,继续增加剂量,并不会使延寿率继续增加,有效成分的延寿作用会出现饱和状态。适当剂量的IYS4具有提高SOD活性、CAT活性、抑制MDA生成的作用,剂量过高反而效果下降。GSH-Px活性随IYS4给药剂量的提高而明显提高。Vc无提高GSH-Px活性的作用并会促进MDA在体内的生成。果蝇体内抗氧化抗衰老活性也与藏波罗花提取物中化合物A和B的总含量直接成正相关关系(或者说化合物A和B具有果蝇体内抗氧化活性)。 安全性实验结果显示,藏波罗花80%乙醇提取物IYS1对雌雄小鼠无经口急性毒性;小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验和小鼠精子畸形实验结果均为阴性,未见其有遗传毒性。……