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产几丁质酶细菌的鉴定及产酶和酶学性质的研究

张莉

   农业和林业上遇到的病害几乎都是由昆虫和真菌引起的,仔细研究不难发现,这两大类的一个非常重要的共同点,那就是其外屏蔽都是由几丁质组成的。所以,在发现了化学农药对环境和人类造成的不可弥补的重大灾害后,人们把注意力朝向了生物防治,因而几丁质的分解主力—几丁质酶就无疑地成了人们的研究重点。几丁质酶的来源多种多样,有植物几丁质酶,动物几丁质酶和微生物几丁质酶,这其中由于微生物的各种特性,如体积小,面积大,吸收多,转化快,生长旺,繁殖快,适应强,易变异,分布广,种类多,基因提取和转化的方便快捷等等,使其成为多数学者找寻几丁质酶的对象。因此,不断地去寻找筛选产几丁质酶的微生物,并纯化其所产几丁质酶,研究其性质、作用方式及其作用效果,是目前生物防治研究中的一个新的热点。 以典型昆虫(家蚕)为实验材料,从自然死亡个体的病患部位,即中肠围食膜出发,分离筛选产几丁质酶菌株。为了能使筛选几率最大限度的提高,本试验所用的筛选培养基中仅以胶体几丁质作为唯一碳原,使只能利用胶体几丁质的菌株才能在该平板上生长。在无菌条件下,用接种环将死亡个体中肠围食膜病患部位组织捣碎,挑出,然后在几丁质平板上划线,放置28℃培养,72 h后,平板中长出各种不同的能利用胶体几丁质的菌株,挑取水解圈/菌落直径之比最大的菌落,得到一株产几丁质酶细菌,命名为zll-r。于同样的胶体几丁质培养基平板上连续五代划线,所得到的水解圈/菌落直径比值变化不大,这说明该菌株具有稳定的产酶传代能力。本实验室对该菌株的保藏采用的是甘油速冻保存法和石蜡斜面保存法。 为确定该菌株在生物防治中的作用,将zll-r菌株接种于胶体几丁质培养基中纯培养72 h后,将发酵液稀释1/2后分别以涂布法和喷洒法喂食家蚕、菜青虫及草原蝗虫,测定其生物防治效果,结果表明该菌株对家蚕、菜青虫及稻蝗的致死率分别为50%、73.33%和60%。在证实了zll-r菌株有生物防治效果后,对其进行了菌种鉴定。结合传统的表型分类、化学分类和现代的分子分类等细菌分类方法,对菌株zll-r进行了形态特征、培养特征、生理生化及16S rDNA序列分析。分子生物学鉴定的过程如下:细菌基因组的提取与纯化;设计16S rDNA引物,通过PCR技术得到16S rDNA片断:连接过夜,转化大肠杆菌感受态,涂布Amp平板,37℃培养过夜,挑选阳性菌落,提取质粒,酶切检验等过程,将16S rDNA进行测序分析。将得出的基因序列在Genebank登录,根据测序结果,用Ribosomal Database Project(RDPⅡ)核酸数据库进行序列比对,从RDPⅡ数据库中选择15个同源性最高的模式菌株与zll-r进行进化树分析。通过形态学观察,生理生化测定及分子生物学鉴定,初步将zll-r菌株归为气单胞菌属(Aeromonas spp.)。 为了能更好地了解并改善该菌株产几丁质酶的条件,本试验对该菌株的发酵条件进行了优化,优化分别是从发酵时间,发酵温度,发酵起始pH值,培养基装量,碳原,氮原等方面进行的。经过初步研究,发现该菌株的最佳诱导物为粉状几丁质,其次为胶体几丁质,而片状几丁质几乎不被其利用。通过各种条件下单因素的变化和均匀设计法对该菌株的产酶条件进行优化,得出该菌株产酶的最适环境是:粉状几丁质1.2%(w/w),氮源蛋白胨0.12%(w/w)和K_2HPO_40.02%(w/w),发酵72 h,温度为30℃,起始pH为8.0,培养基装量为15%。本试验还对该菌株所产生的粗酶液的性质进行了初步研究,结果表明该菌株所产的几丁质酶的最佳作用温度为25℃,最佳的作用pH值是5.5,耐温性较差,在45℃以上就丧失50%以上的活力,但在pH 5.0-9.0之间酶活力有很好的稳定性(>88%)。……   
[关键词]:几丁质;几丁质酶;菌株分离;生物测定;菌种鉴定;气单胞菌属;发酵优化;酶学性质
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川大学2007年