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新霉素人工抗原的构建、多克隆抗体的制备及检测方法的初步研究

刘沙洲

   新霉素(Neomycin,NEO)属于氨基糖苷类抗生素,具有抗菌谱广的特点,对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和结核杆菌均有良好的抑制作用,在兽医临床上应用广泛,是重要的抗感染药物,还被普遍用于治疗乳腺炎、角膜炎、结膜炎、耳炎、皮炎、外伤感染、足腐烂等疾病。我国和其它一些国家还将新霉素作为饲料抗生素添加剂使用,用于预防畜禽感染引起的早期损失和肠炎,提高饲料利用率,促进生长。 虽然新霉素在兽医和畜牧上使用取得了巨大的成功,但其对人和动物存在潜在的耳毒性和肾毒性,为了公众的健康,对食物中新霉素残留进行检测十分必要。为了有效检测动物及食品里新霉素的残余物,保护消费者,需要研究一种简单快速有效的检测方法。 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)在抗生素残留检测的领域应用相当广泛。建立新霉素ELISA检测方法首先需要获取高质量、稳定的新霉素人工抗原。针对新霉素没有特征紫外吸收的特点,本论文建立了新霉素人工抗原的红外光谱分析法,对新霉素人工抗原的质量进行检测。并在此基础上优化人工抗原制备方法,制备新霉素人工抗原,获取新霉素抗血清,并初步建立新霉素ELISA检测方法。 到目前为止,我国还没有新霉素残留ELISA检测方法的研究报道。因此,研发新霉素残留ELISA检测方法具有很强的社会意义和经济意义。 本论文取得如下结果: 1.建立新霉素人工抗原的红外光谱分析方法。根据新霉素没有特征紫外吸收的特点,采用红外光谱来对新霉素人工抗原进行分析,建立新霉素人工抗原的红外光谱分析方法,为氨基糖苷类抗生素的抗原检测提供了新的技术支持。 2.优化新霉素人工抗原偶联方法。以红外光谱分析为基础,优化新霉素和载体蛋白的偶联条件,确定反应温度25℃,偶联剂浓度8.3mg/mL。 3.成功制备稳定性好的新霉素人工抗原BSA-NEO和KLH-NEO。采用优化后的偶联方法,分别将新霉素和牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)进行偶联,得到新霉素人工抗原BSA-NEO和KLH-NEO。通过红外光谱分析,初步测定BSA和NEO偶联比率为1:3,KLH和NEO偶联比率为1:10。 4.成功制备新霉素高效价抗血清。将偶联成功的人工抗原BSA-NE和KLH-NEO作为新霉素免疫抗原,免疫新西兰大白兔,获得抗血清。分别将BSA-NEO和KLH-NEO作为包被抗原,采用间接ELISA法测定KLH-NEO抗血清和BSA-NEO抗血清的效价,测定抗血清效价。用BSA-NEO免疫的两只新西兰大白兔产生的抗血清效价达到1:1.28×10~5以上,用KLH-NEO免疫的一只新西兰大白兔产生的抗血清效价达到1:1.28×10~5以上,另外一只产生的抗血清效价相对较低。新霉素抗血清的制备成功,进一步论证新霉素人工抗原红外光谱分析法的可行性。 5.优化直接竞争ELISA反应条件并建立新霉素标准曲线。确定最佳包被抗血清浓度为1:1000稀释,最佳HRP-NEO浓度为1:500稀释,最佳反应时间60min。建立新霉素回归方程y=-16.475x+113.76,R~=0.9962,标准曲线平均变异系数3.82%。检测极限27.67 ng/mL,达到国家对新霉素规定的500μg/kg MRL检测限。 6.优化间接竞争ELISA反应条件并建立新霉素标准曲线。确定最佳酶标二抗浓度为1:2000稀释,最佳抗血清浓度为1:2000稀释,最佳包被抗原浓度1:400稀释,最佳反应时间60min。建立新霉素回归方程y=-11.35x+109.36,R~2=0.9945,标准曲线变异系数1.71%,检测极限51.29ng/mL,达到国家对新霉素规定的500μg/kg MRL检测限。 7.在间接竞争ELISA法下,新霉素抗血清和庆大霉素的交叉反应率为2.04%,和卡那霉素的交叉反应率为0.02%,和氨苄青霉素、红霉素、四环素的交叉反应率小于0.01%,说明新霉素多克隆抗体在间接竞争ELISA体系下可以特异性的识别新霉素,测定时不受其它抗生素影响。初步测试新霉素间接竞争ELISA法回收率为132.5%~246.5%。……   
[关键词]:新霉素;人工抗原;红外光谱;多克隆抗体;ELISA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川大学2007年