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PTD-SH2融合蛋白的原核表达和纯化

邱波

   肝癌是威胁人类健康的常见恶性肿瘤,全世界每年大约有100万人死于该病。而我国是肝癌高发地区,全世界每年新发病例中大约45%在中国。由于常常并发肝硬化以及其快速的浸润性生长方式,肝癌的预后往往不理想。肝切除术、肝移植、冷冻、射频及微波疗法等是目前主要的治疗方法,由于单一治疗模式效果往往并不理想,故现多采用多种治疗方式联合应用的综合疗法。攻克肝癌已成为亟待解决的重大课题。 诱导肿瘤细胞调亡是现在肿瘤治疗研究中的新领域,相关的生物学药物既达到了杀伤肿瘤细胞的目的,又避免了由于本身的毒副作用和肿瘤细胞死亡后的炎性反应的影响,为恶性肿瘤的治疗开辟了新的前景。 目前许多研究表明酪氨酸蛋白激酶(PTKs)在细胞内的信号转导通路中占据了十分重要的地位,酪氨酸激酶的过表达及其诱导的异常增值信号转导与肝癌发生有着明显的相关性。Src是第一个被发现具有酪氨酸蛋白激酶活性的癌蛋白。原癌基因c-Src在调节人正常细胞的生长、发育、分化和其他生物学功能方面具有重要的作用。此外,其蛋白产物在多种肿瘤细胞中高度活化和/或过量表达,且由癌细胞分离出来的c-Src基因具有较强的转化细胞的能力,其异常表达和肿瘤的发生发展密切相关。人类许多肿瘤,例如结肠癌、乳腺癌、胰腺癌和肺腺癌,都存在Src蛋白的过度表达和活化。而SH2结构域,是一种广泛存在于PTKs中的重要的参与信号转导的蛋白结合结构域,因此由PTKs活性增强而导致的src,abl,ras,raf等癌基因的活化均直接或间接地由SH2结构域所介导。故SH2已成为新的干预恶性肿瘤异常信号转导途径的靶位点。蛋白转导结构域(protein transduction domain, PTD)与其它外源性蛋白融合表达后,可以穿越细胞膜性结构,直接进入细胞浆,使生物大分子以非受体依赖方式进入细胞。其可介导提高效应分子向细胞内的转运,从而提高细胞杀伤效应,而且具有转导速度快、效率高的特点。本研究通过筛选Src蛋白中有效的SH2结构域的基因序列,我们克隆表达全长融合基因PTD-SH2,在SH2的5’端融合PTD后在E. coli DE3中高效表达并纯化蛋白,为后续的以SH2结构域为靶位点的肝癌基因治疗方法的可行性奠定了实验基础。 目的:构建含SH2与蛋白转导结构域(PTD)融合基因片段的重组表达载体,在大肠杆菌中进行表达并纯化蛋白。 方法:通过PCR方法扩增出人类Src蛋白中SH2基因,克隆入pMD-18T载体,进行测序分析,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-16b中PTD的下游构建重组质粒pET-16b-PTD-SH2,转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,将已表达的蛋白质通过Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化。 结果: 297 bp的目的片段SH2被有效地扩增,经电泳鉴定和序列分析表明成功构建了重组融合表达质粒pET-16b-PTD-SH2,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在约Mr为15×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的16%,可溶性分析发现融合蛋白主要以包涵体形式存在,纯化后得到了目的蛋白,且目的蛋白与抗His标签抗体有良好的反应性。 结论:成功地克隆了人类的SH2基因,构建了含PTD- SH2的重组表达载体,并使融合蛋白在E. coli DE3中高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白,为后续制备多抗及功能研究以SH2结构域为靶位点的肝癌基因治疗方法奠定了基础。……   
[关键词]:肝细胞肝癌;Src蛋白;SH2基因;融合蛋白;表达;纯化;pET-16b载体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第四军医大学2007年