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钙离子载体A23187诱导急性髓性白血病细胞分化为树突状细胞的研究

杨昆

   背景和目的 儿童急性髓性白血病(AML)治疗效果差,容易复发,复发的根源为体内微小残留病(MRD)的存在,而MRD的根除需要有效启动T细胞介导的细胞毒免疫反应。然而,AML白血病细胞MHC、共刺激分子和黏附分子表达量低或不表达,不能将白血病抗原有效地提呈给T细胞从而启动机体特异性抗白血病免疫应答。因此,清除MRD而达到防止复发和根治白血病的关键是将白血病抗原有效地提呈给T细胞并激活T细胞介导的抗白血病免疫应答。树突状细胞(DC)是目前功能最强,也是唯一可直接活化初始型T细胞的抗原提呈细胞,其独特的功能在肿瘤免疫中备受关注。用细胞因子(CK)体外诱导培养DC的方法现己非常成熟,但存在代价昂贵、培养时间长、易污染以及某些急性髓性白血病不能诱导生成DC等缺点。近年发现钙动员可快速诱导外周血单个核细胞、CD34~+造血祖细胞等正常细胞分化为DC。 本实验第一部分用钙离子载体A23187将对多种细胞因子诱导不敏感的髓系白血病细胞株HL-60细胞快速诱导分化为成熟DC,并对其形态学、免疫表型及刺激T淋巴细胞增殖功能进行分析;第二部分引入蛋白激酶C(PKC)特异性抑制剂Bis-1,初步探讨细胞内PKC信号途径在A23187诱导HL-60细胞向DC分化过程中的作用,了解细胞内钙信号转导途径与PKC信号途径是否存在相互应答;第三部分探讨临床AML患儿不同FAB亚型的原代白血病细胞在体外被钙离子载体A23187诱导生成DC的可能性。白血病来源的DC不仅携带着白血病细胞的全部抗原信息,而且不会发生排斥反应,为临床彻底清除AML患者体内的微小残留病提供了一条前景乐观的途径。 方法 1.用钙离子载体A23187或联合rhIFN-(?)诱导髓系白血病细胞株HL-60细胞分化为DC,用倒置显微镜和扫描电镜观察其形态学特征,流式细胞仪检测其免疫表型,混合淋巴细胞反应检测其刺激T淋巴细胞的能力。 2.用蛋白激酶C特异性抑制剂Bis-1预先处理HL-60细胞再用A23187处理,比较先经Bis-1处理的HL-60细胞与单用A23187处理的HL-60细胞在形态学、免疫表型及刺激T细胞增殖能力方面的异同。 3.分离12例初诊急性髓性白血病患儿的骨髓或外周血单个核细胞,用A23187培养3~4天,进行形态学、免疫表型及功能的检测和分析。 3.用PKC特异性抑制剂Bis-1预先处理再予A23187处理的HL-60细胞其形态、免疫表型及刺激T淋巴细胞增殖的能力均受到不同程度的抑制,细胞表面DC特异抗原CD83、CDS0、CD86分子的阳性表达率分别为(13.23±2.15)%、(9.70±1.69)%、(23.37±7.50)%,与单用A23187处理的HL-60细胞比较,有统计学差异(P值均<0.05)。 4.12例AML患者中有10例患者(其中M_1型1例、M_2型1例、M_3型2例、M_4型1例、M_5型5例)的白血病细胞经A23187培养3~4d后出现符合典型DC形态的细胞,但有2例AML患者白血病细胞的形态始终无明显变化;12例AML患者中有10例患者的白血病细胞经A23187诱导后出现CD83、CD80、CD86分子表达升高:培养前细胞CD83、CD80、CD86分子的阳性表达率分别为(2.06±0.95)%、(2.24±1.05)%、(3.61±1.43)%,经A23187诱导后,CD83、CD80、CD86分子表达均明显增高,分别为(28.19±8.21)%、(45.32±9.90)%、(58.67±12.17)%,与培养前相比有统计学差异(P值均<0.05)。12例AML患者中有10例患者的白血病细胞经A23187诱导后刺激T淋巴细胞增殖的能力明显增强。此外,AML患儿M_4/M_5型与非M_4/M_5型来源的AML细胞在A23187诱导前后免疫表型比较发现,M_4/M_5型的白血病细胞更易诱导生成DC样细胞,其细胞表面成熟DC免疫标记CD83、共刺激分子CD80、CD86的表达率均明显高于非M_4/M_5来源的DC,差异有统计学意义(P值<0.05)。外周血与骨髓来源的白血病细胞诱生为DC的表面免疫标志的表达率的差异无统计学意义(P值>0.05)。 结论 1.钙离子载体A23187可使急性髓细胞白血病细胞株HL-60细胞快速诱导分化为成熟DC。 2.单用IFN-(?)处理HL-60细胞,未能获得DC样细胞;联合CI-A23187诱导HL-60细胞可获得更成熟、刺激T细胞增殖能力更强的DC。 3.PKC特异性抑制剂Bis-1在A23187诱导HL-60细胞分化为DC的过程中起抑制作用,表明PKC信号路径参与A23187诱导AML白血病细胞分化为DC的过程。 4.多数AML患者的白血病细胞经A23187诱导3~4d分化为DC,部分病例不能诱导成DC,表明AML因具有生物学异质性而对同一种诱导剂的反应不同。M_4/M_5型白血病细胞体外培养易生成具有树突状细胞形态、特征的细胞。AML患儿外周血和骨髓样本来源的DC表面标志表达率无统计学差异,对于外周血白血病细胞比率高的病人,可采集外周血样本来取代骨髓样本诱导白血病DC。……   
[关键词]:树突状细胞;急性髓性白血病;钙离子载体;rhIFN-γ;蛋白激酶C
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:四川大学2007年