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鼠避孕DNA疫苗受精素β_(.ECD)-C3d3的制备及其避孕效应的实验研究

孙中义

   背景与目的: 目前虽然己有多种药物、工具及手术用于控制生育,但仍缺乏能为两性所普遍接受的理想避孕措施,随着基因重组技术的发展和人们对受精过程的分子基础和详细机理认识的深入,免疫性避孕疫苗将可能成为控制生育的理想措施。 阻断精-卵结合是免疫性避孕研究的热点,精子抗原受精素(fertilin)在精子与卵子透明带(zona pellucida,ZP)结合及与精-卵膜的结合和融合过程中发挥重要作用,是具有重要潜在价值的睾丸组织特异性抗原,受精素单克隆抗体PH-30可抑制体外受精时精卵质膜融合过程,并且PH-30能够抑制豚鼠无透明带卵细胞与精子结合。受精素是由α和β两个亚单位组成的异质二聚体,其中β亚单位(F_β)是重要的功能单位。 血清补体蛋白C3是宿主先天性免疫防御补体系统(complement system,CS)的中心分子,在补体活化的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集途径中均发挥枢纽作用。C3d是C3的裂解产物之一,可通过特异性补体受体2(CR2/CD21)将抗原信号提供给免疫细胞,增强特异性免疫应答,降低免疫系统的活化阈,使无免疫原性或免疫原性弱的抗原亦能产生较强的免疫反应,从而发挥极强的免疫佐剂效应,且由于是自身成分,不会出现完全弗氏佐剂(complete Freund s adjuvant, CFA)等引起的毒性作用。 本研究选择F_β胞外段(F_βextracellular domain, F_β. ECD)作为靶抗原,将F_βcDNA中编码胞外段部分的1168bp-2058bp片段分别插入真核表达质粒pSG.SS.C3d3.YL及pSG.SS.YL中,构建可在真核细胞表达分泌型融合蛋白F_(β.ECD)-C3d3及F_(β.ECD)蛋白的质粒pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD)及pSG.SS.YL-F_(β.ECD),用作免疫接种的DNA避孕疫苗,观察其避孕效果。 方法: 1.以质粒pYA3149-F_β为模板,PCR扩增得到编码F_β胞外段(1168bp-2058bp)的cDNA片段,再通过限制性内切酶酶切等步骤,分别将该片段定向克隆入真核表达质粒pSG. SS.C3d3.YL和pSG.SS.YL中,构建分别编码F_(β.ECD)-C3d3融合蛋白基因及F_(β.ECD)蛋白基因的质粒pSG.SS. C3d3.YL- F_(β.ECD)和pSG.SS.YL-F_(β.ECD)。 2.经酶切及测序证实构建的真核表达质粒pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD)和pSG.SS.YL- F_(β.ECD)符合设计要求。 3.采用Western blot、免疫细胞化学染色等技术验证质粒pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD)和pSG.SS.YL- F_(β.ECD)转染真核细胞后能表达F_(β.ECD)-C3d3融合蛋白和F_(β.ECD)蛋白。 4.将pSG. SS.C3d3.YL-F_(β.ECD) DNA疫苗接种雌性昆明小鼠,观察雌鼠免疫避孕效应,检测免疫小鼠血清中抗F_(β.ECD) IgG及阴道分泌物IgA抗体滴度变化,同时观察雌鼠血清IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10水平的变化。 5.将pSG. SS.C3d3.YL-F_(β.ECD) DNA疫苗接种雄性昆明小鼠,观察免疫避孕效应,检测免疫小鼠血清中抗F_(β.ECD) IgG抗体滴度变化,同时观察免疫鼠血清IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10水平的变化。 结果: 1.以质粒pYA3149-F_β为模板,PCR扩增获取了编码F_β胞外段的cDNA片段,再通过限制性内切酶酶切等步骤,将该片段定向克隆入真核表达质粒pSG.SS.C3d3.YL和pSG.SS.YL中,构建了编码F_(β.ECD)-C3d3融合蛋白基因及F_(β.ECD)蛋白基因的质粒pSG.SS. C3d3.YL- F_(β.ECD)和pSG.SS.YL-F_(β.ECD)。 2.构建获得的真核表达质粒pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD)和pSG.SS.YL-F_(β.ECD)经酶切及测序证实符合设计要求。 3. Western blot、免疫细胞化学染色等实验验证,质粒pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD)和pSG.SS.YL-F_(β.ECD)转染真核细胞后能表达F_(β.ECD)-C3d3融合蛋白和F_(β.ECD)蛋白,融合蛋白中的F_(β.ECD)未因其后串联了C3d3而影响特异性单抗对其进行识别,C3d3也未因与F_(β.ECD)的耦联而丧失与受体结合的生物学活性。 4. DNA疫苗免疫雌鼠避孕实验结果显示:pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD) DNA疫苗免疫雌鼠后,雌鼠妊娠率降低,一胎产仔数量显著降低,其避孕效应较pSG.SS.YL-F_(β.ECD)显著。特异性抗体在未加强免疫时即已产生,而且滴度高,维持时间长,抗体生成远远强于单独的pSG.SS.YL-F_(β.ECD) DNA免疫。血清IL-2和INF-γ浓度呈降低趋势,IL-4和IL-10浓度呈升高趋势。 5. DNA疫苗免疫雄鼠避孕实验结果显示:pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD) DNA疫苗免疫雄鼠后,雌鼠受孕率降低,一胎产仔数量显著降低,血清IL-2和INF-γ浓度呈降低趋势,IL-4和IL-10浓度呈升高趋势,其避孕效应较pSG.SS.YL-F_(β.ECD)显著。 结论: 1.成功构建了编码F_(β.ECD)-C3d3融合蛋白基因及F_(β.ECD)蛋白基因的质粒pSG.SS. C3d3.YL- F_(β.ECD)和pSG.SS.YL-F_(β.ECD)。 2.质粒pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD)和pSG.SS.YL-F_(β.ECD)转染真核细胞后能表达F_(β.ECD)- C3d3融合蛋白和F_(β.ECD)蛋白。 3. pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD) DNA疫苗可有效免疫雌鼠,使其妊娠率及一胎产仔数量显著降低,其避孕效应较pSG.SS.YL-F_(β.ECD)显著。pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD) DNA疫苗可有效免疫雄鼠,使雌鼠受孕率及一胎产仔数量显著降低,其避孕效应较pSG.SS.YL -F_(β.ECD)显著。 4. C3d分子佐剂能升高体液免疫相关细胞因子的表达。综上所述,本研究成功构建了F_(β.ECD)-C3d3 DNA疫苗,可诱导小鼠产生针对F_β的主动免疫反应,产生有效的雌鼠和雄鼠的避孕效应,从而为通过主动免疫方式进行生育控制所需的DNA疫苗的开发和应用奠定了理论和实验基础。……   
[关键词]:精子抗原;避孕疫苗;质粒;受精;免疫;DNA疫苗;补体
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:第三军医大学2007年