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金黄色葡萄球菌肽聚糖的分离提取及其生物学活性鉴定

张向武

   脓毒症(sepsis)是由感染因素介导的全身炎症反应综合征,在所有导致脓毒症发病的病原体中,细菌感染占脓毒症发病的95%以上。过去10年中由G+菌引起的脓毒症休克明显增多,目前已达脓毒症发病率的52.1%。G+菌脓毒症中,肽聚糖是最重要的病原分子之一。目前,购买的肽聚糖水溶性差,并且价格昂贵,从而限制了对G+菌感染所致脓毒症的研究,因此,寻找一种简单、经济的分离提取可溶性肽聚糖的方法,为G+菌脓毒症发病机理以及防治的研究提供实验材料具有重要意义。 目的: 建立和完善一套从金黄色葡萄球菌中分离提取肽聚糖的方法,并对其生物学活性进行鉴定。 方法: 1.金黄色葡萄球菌不溶性肽聚糖的分离提取 (1)金黄色葡萄球菌ATCC25923增菌培养、收集,采用冷熔和超声破碎,提取金黄色葡萄球菌不溶性肽聚糖; (2)金黄色葡萄球菌ATCC25923增菌培养、收集,经10%三氯乙酸和5%三氯乙酸浸泡后,采用含有胰蛋白酶的NH4HCO3缓冲液消化,提取金黄色葡萄球菌不溶性肽聚糖。 2.金黄色葡萄球菌可溶性肽聚糖的分离提取及其质量控制 (1)采用青霉素钠诱导法和葡聚糖G-100(Sephadex G-100)凝胶柱分离提取金黄色葡萄球菌可溶性肽聚糖; (2)金黄色葡萄球菌可溶性肽聚糖提取过程中的质量控制:采用SLP试剂盒对提取物定性检测,应用动态浊度法鲎试验测定提取物中内毒素(LPS)含量,采用改良LOWRY试剂检测提取物中蛋白的含量; (3)采用青霉素诱导和Sephadex G-100凝胶柱分离提取金黄色葡萄球菌可溶性肽聚糖的条件:青霉素使用量、加入青霉素后孵育时间和菌液浓度等优化选择。 3.金黄色葡萄球菌可溶性肽聚糖的生物学活性鉴定 (1)金黄色葡萄球菌可溶性肽聚糖活化小鼠RAW264.7细胞实验:采用ELISA试剂盒检测金黄色葡萄球菌可溶性肽聚糖各个剂量组(250、500、1000、1500ng/ml,共四组)活化小鼠RAW264.7细胞释放肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)的情况; (2)金黄色葡萄球菌可溶性肽聚糖攻击小鼠的体内实验:观察金黄色葡萄球菌可溶性肽聚糖各个剂量组(40、60、80、100、200mg/kg,共5组)攻击小鼠后小鼠72h存活率情况。 结果: 1.冷熔超声法提取金葡菌不溶性PGN,收益率为0.84%;三氯乙酸和加有胰蛋白酶的NH4HCO3缓冲液共同作用提取金葡菌不溶性PGN,其收益率为1.02%; 2.应用青霉素诱导和Sephadex G-100凝胶柱成功分离得到金葡菌可溶性PGN;所制备的可溶性PGN经SLP试剂检测结果为阳性;动态浊度鲎实验检测制备的可溶性PGN(10ng/ml)中LPS含量小于0.01ng/ml;改良LOWRY试剂检测可溶性PGN(1.0mg/ml)中蛋白含量为0.06mg/ml;青霉素诱导和Sephadex G-100凝胶柱法提取金葡菌可溶性PGN的最佳条件是:青霉素的使用浓度为0.75mg/ml,菌液浓度为5×108CFU/ml,加入青霉素后孵育时间为1h。 3.所制备的可溶性PGN各剂量组均能够活化小鼠RAW264.7细胞释放TNF-α,并呈一定的量效关系,其效应约为LPS效应的1/15;经过动物实验证明,所制备的可溶性PGN(100mg/kg)组72小时攻击小鼠,72h存活率均稳定在40-50%左右,小鼠致死作用明显。 结论: 1.应用冷熔超声法和强酸弱碱胰蛋白酶消化法,都能够破碎金黄色葡萄球菌,分离提取肽聚糖,但是得到的肽聚糖为水不溶性,收益率均较低; 2.建立并完善了青霉素诱导和Sephadex G-100凝胶柱法制备金黄色葡萄球菌可溶性肽聚糖的方法;经SLP试剂、鲎试验及改良的LOWRY试剂检测,所制备的金黄色葡萄球菌可溶性肽聚糖中LPS和蛋白的污染均较少,纯度达到93%以上; 3.所制备的金黄色葡萄球菌可溶性肽聚糖在体外能够活化小鼠RAW264.7细胞释放TNF-α;用100mg/kg的SPGN攻击小鼠,72h小鼠死亡率保持在40~50%,致死作用明显。……   
[关键词]:肽聚糖;可溶性肽聚糖;不溶性肽聚糖;肿瘤坏死因子α;金黄色葡萄球菌
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第三军医大学2007年