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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)PBP2a C-末端的克隆、表达以及拮抗MRSA中药的筛选

和生琦

   目的MRSA(methicillin resistant Staphylococcus aureus)感染是烧伤和严重创伤中最常见的并发症之一, MRSA的耐药机制主要与其mecA基因大量表达产生的特殊青霉素结合蛋白PBP2a有关。该蛋白由668个氨基酸组成,分子量为76.1 kDa,对所有β-内酰胺类抗生素亲和力低。水溶性的PBP2a为去除N-末端23个氨基酸后的蛋白质(不影响PBP2a与β-内酰胺类抗生素的结合),其有二个功能域:N-末端非青霉素结合域(24-326 aa),C-末端(327-668 aa)功能域。目前已知N-末端负责蛋白的延伸和锚定;C-末端则具有转肽酶活性和β-内酰胺酶的作用。当β-内酰胺类抗生素抑制了由金葡菌产生的敏感的PBPs时,由于PBP2a对β-内酰胺类抗生素亲和力极低,可以替代这些蛋白的功能进行细胞壁的合成。在金葡菌临床分离株中,日本、台湾、新加坡的MRSA检出率都>60%,意大利、葡萄牙的MRSA检出率也都>50%。这些临床分离株大多是多重耐药,仅对糖肽类抗生素如万古霉素敏感。然而,1996年在日本分离到万古霉素中度敏感的MRSA,随后2002年在美国发现万古霉素耐药的MRSA,至今尚无有效的治疗MRSA感染药物,所以急需寻找新的的药物来杀灭MRSA或减少其耐药性。文献报道有许多中药具有抗MRSA的作用,所以极有可能从中药里筛选到杀灭MRSA或减少其耐药性的新药或先导物。 基于如此严峻的MRSA感染及耐药形势,本研究旨在采用基因重组技术获得PBP2a C -末端,并以此为靶点应用生物传感器技术筛选具有与PBP2a C -末端高结合力的中药,并对其活性组分分离研究,为进一步分离纯化抑制PBP2a的活性单体提供良好的物质基础。 方法①MRSA的鉴定:采用二倍微孔稀释法测定β-内酰胺类抗生素对MRSA细菌的最小抑菌浓度;采用PCR法鉴定mecA基因;②PCR方法扩增编码PBP2a C -末端的mecA基因的开放阅读框,构建重组载体pQE30-mecA,转化大肠杆菌并诱导表达PBP2a C -末端功能域,将对PBP2a C -末端多肽表达、纯化及鉴定;③将PBP2a C -末端包被于生物传感器的生物素化样品池;④采用生物传感器技术观察测定115种中药水煎液去鞣质后与PBP2a C -末端的结合力;⑤选择结合力较高的25种药物水提液和醇提液与定量PBP2a C -末端(50 ng/ml) 37℃混合孵育30 min,再测定其与PBP2a C -末端的结合力,以评价中药里活性物质的含量。⑥与PBP2a C -末端高结合力中药与β-内酰胺类抗生素联合应用效果的评价。⑦黄连活性组分的分离及体外抗菌活性测定。 结果①26株MRSA临床分离株对苯唑西林钠、加替沙星、青霉素钠、舒氨西林、泰能等均耐药,而对万古霉素敏感;②26株MRSA临床分离株中,有22株mecA基因检测阳性;③成功构建重组载体pQE30-mecA,转化到大肠杆菌中表达纯化获得可溶性PBP2a C -末端;④将PBP2a C -末端包被于生物传感器的生物素化样品池;⑤采用生物传感器技术测定115种中药水煎液去鞣质后与PBP2a C -末端的结合力;⑥将筛选出的结合力较高的25种中药与定量PBP2a C -末端的消耗实验后,黄药子、五倍子、半枝莲、山豆根、黄连、草果、核桃根等7种中药具有较高的与PBP2a C -末端结合的物质,与β-内酰胺类抗生素联用后都能不同程度地降低其对MRSA的MIC。⑦分离的黄连活性组分能降低β-内酰胺类抗生素对MRSA的MIC。 结论PBP2a C -末端mecA基因原核表达载体可在大肠杆菌中高效表达,115种中药水煎液去鞣质后与PBP2a C -末端有不同的结合力,其中黄药子、五倍子、半枝莲、山豆根、黄连、草果、核桃根等7种中药具有较高的能与PBP2a C -末端结合的物质,与β-内酰胺类抗生素联用后都能不同程度地减少其对MRSA的MIC,可以进行进一步的分离和筛选。分离的黄连活性组分能降低β-内酰胺类抗生素对MRSA的MIC。……   
[关键词]:MRSA;PBP2a C -末端;生物传感器;中药;结合力;黄连
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第三军医大学2007年