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1-4型登革病毒外膜蛋白基因DⅢ区的表达及其在血清学诊断和免疫保护方面的应用研究

张志珊

   近年来,随着登革热流行的日益严重,对登革病毒进行有效的防治是全世界共同关注的问题。本课题以登革病毒外膜基因DⅢ区(EDⅢ)为研究对象,进行诊断试剂盒的研制,同时构建了3种类型的登革疫苗进行免疫保护的研究。一、1-4型登革病毒外膜蛋白基因DⅢ区的表达及重组抗原在血清学诊断中的应用 在大肠杆菌BL21(DE3)中分别克隆、表达1-4型登革病毒外膜蛋白基因DⅢ区,重组蛋白用电洗脱法进行纯化。纯化后的DEN1-4型重组蛋白分别应用于间接ELISA法检测相应型别DEN IgG抗体,以IFA为标准,其敏感性为100%;DEN1型重组蛋白应用于捕获ELISA法检测DEN1型感染者IgM抗体,不仅能检出所有IFA法IgM阳性的标本,而且还检出了2份IFA法未能检出的早期标本;DEN1型重组蛋白应用于夹心ELISA法检测DEN1型感染者IgM/IgG总抗体,其敏感性为82.6%;以IFA为标准,三种方法的特异性均为100%。纯化的重组蛋白混和后作为捕获抗原制成金标试剂条,应用于登革病毒感染者的检测,与PanBio公司的金标条检测结果相比,两者无显著性差别(P>0.05)。 二、登革疫苗的研制及免疫保护作用分析 1. 1-4型登革病毒重组亚单位疫苗的研制及免疫原性分析利用连接肽(Gly-Gly-Ser-Gly-Ser)3将DEN 1型与2型,3型与4型的EDⅢ基因片段连接在一起,构建了EDⅢ融合基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达融合重组蛋白。重组蛋白经高效液相色谱(HPLC)纯化后免疫BALB/c鼠,采用中和实验法测定血清DEN1-4型中和抗体效价,其滴度分别为1:34.9、1:45.3、1:24.7、1:38.4。免疫血清分别与1-4型的登革病毒作用后,攻击乳鼠,免疫血清对乳鼠保护率分别为100%、100%、83%、83%。 2.登革病毒EDⅢ融合基因真核表达载体的构建及DNA在小鼠中的免疫原性观察 构建DEN1/2型、DEN3/4型EDⅢ融合基因的真核表达载体,用间接免疫荧光法和Western blot法检测重组真核表达载体在BHK-21细胞中的表达情况。结果表明,重组真核表达载体能在BHK-21细胞中表达目的蛋白。DNA质粒免疫BALB/c鼠,采用中和实验法测定血清DEN1-4中和抗体效价,其滴度分别为1:24.7、1:26.9、1:13.4、1:16.0。 3.EDⅢ融合蛋白及DNA质粒联合免疫小鼠诱生中和抗体的分析 将DⅢ融合重组蛋白及含有EDⅢ融合基因的DNA质粒单独或联合免疫小鼠,观察其对小鼠的免疫原性,比较诱生中和抗体的能力。结果表明,联合免疫组产生的中和抗体效价显著高于重组蛋白免疫组及DNA免疫组,同时蛋白免疫组与DNA免疫组比较,中和抗体也表现为增高。 4.登革病毒EDⅢ区融合基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 采用腺病毒表达系统,构建DEN1/2型、DEN3/4型EDⅢ融合基因的重组腺病毒表达载体,并且在293A细胞系中包装成具有感染性的重组腺病毒,病毒滴度可达109PFU/ml。重组腺病毒感染哺乳动物细胞后,用间接免疫荧光法和Western blot法检测重组蛋白在细胞中的表达情况,结果显示,重组腺病毒感染哺乳动物细胞后能够表达目的蛋白。……   
[关键词]:登革病毒;外膜蛋白;DⅢ区;原核表达;亚单位疫苗;DNA疫苗;腺病毒载体
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:福建医科大学2007年