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弗氏链霉菌及耐热链霉菌的遗传改造

闵勇

   替米考星是一种重要泰乐菌素的衍生物,合成方法是通过水解泰乐菌素得到脱红霉糖泰乐菌素(desmycosin),然后以desmycosin为前体,通过胺化作用在泰乐菌素内酯环的C-20位置上加上一个3,5-二甲基哌啶基而成。泰乐菌素合成基因簇中红霉糖糖基转移酶合成基因tylCV的中断会导致desmycosin的累积。本研究结合SOE-PCR技术和PCR-targeting技术,建立了一种新的链霉菌快速基因中断方法。以泰乐菌素工业生产菌株BIB1028为出发菌株,首先通过SOE-PCR技术构建tylCV基因中断结构,将oriT-aac(3)Ⅳ中断盒按开放阅读框完全置换tylCV基因,然后通过弗氏链霉菌—大肠杆菌属间接合转移将该中断结构导入BIB1028,通过同源重组置换tylCV基因,得到重组突变株BIB715。通过nested-PCR对tylCV基因置换进行了验证,摇瓶发酵结果显示tylCV基因中断导致发酵产物主要为desmycosin。 通过FLP重组酶作用于tylCV基因中断结构中的FRT位点,得到tylCV发生读码框缺失的基因置换结构,将该置换结构插入接合转移载体pBIB1015,通过弗氏链霉菌—大肠杆菌属间接合转移将该基因置换结构导入BIB715,通过同源重组得到tylCV基因发生读码框缺失的重组突变株BIB1209。通过PCR、RT-PCR对置换结果进行了验证,摇瓶发酵实验结果显示主要发酵产物亦为desmycosin。摇瓶菌种筛选以后,在5L发酵罐上对出发菌株BIB1028和两突变株BIB715和BIB1209进行了发酵试验,参照泰乐菌素的发酵工艺,desmycosin的产量分别达到7.3g/l和7.0g/l,相比出发菌株的9.1g/l,通过折算,两突变株的产能达到出发菌株的106±5%。而且和出发菌株的四种组分(泰乐菌素A、脱红霉糖泰乐菌素B、大霉素C和雷洛菌素D)相比,两重组突变株的组分主要有两种(desmycosin和lactenocin),通过提取后,desmycosin能够占到总产量的95%,组分更加单一。 我们还对替米考星的合成方法进行了探讨,与传统合成以泰乐菌素成品—磷酸泰乐菌素为出发原料相比,本研究中所得重组突变株通过发酵得到的desmycosin只需要经过两三步简单处理就可以将90%以上的desmycosin转移至有机相进行替米考星的合成。与传统泰乐菌素的70~80%回收率相比,不但简化了反应步骤,而且提高了得率。HPLC-MS结果显示:合成的替米考星与工业生产的替米考星结构完全一致。 乙酰异戊酰泰乐菌素(AIV)是另一种重要的泰乐菌素衍生物,它是通过耐热链霉菌生物转化泰乐菌素,在泰乐菌素的3’-羟基位置乙酰基化和4”-羟基位置异戊酰基化而得。通过优化,本研究首次建立了优化的耐热链霉菌—大肠杆菌接合转移系统,整合表达了血红蛋白基因(vhb),摇瓶发酵结果显示血红蛋白基因的表达对耐热链霉菌转化泰乐菌素几乎没有影响。通过PCR-targeting和在弗氏链霉菌中应用的快速基因中断法对负责相应酰基化功能的acyB1-B2基因进行了功能研究,先后得到acyB1-B2基因中断菌株、acyB1基因中断菌株,并对相应中断菌株进行了互补,得到相应的基因互补菌株。研究表明:acyB1基因的中断对acyA基因功能没有影响,而以前报道的acyB1的正调控基因acyB2的中断会导致了acyA基因表达水平的下降95%以上。研究表明acyB2基因应该是碳霉素生物合成基因簇中的一个全局性正调控因子,它不仅负责对acyB1基因的正调控作用,而且还至少负责对acyA基因和红霉糖糖基转移酶基因的正调控。 在耐热链霉菌中存在两个抗性基因,分别为carA和carB,其中carA类似泰乐菌素的tlrC,为ATP结合转运蛋白;CarB为核糖体单甲基化酶,类似泰乐菌素的tlrB。为提高AIV生物转化过程中菌体对泰乐菌素的抗性,通过整合表达红霉素抗性基因(ermE),抗性平板结果显示耐热链霉菌对泰乐菌素的抗性提高四倍以上,而相应的酰基化功能没有变化,这对解决工业生产上底物投料浓度问题有一定的帮助。 本研究还对在链霉菌中普遍存在的负调控基因nsdA(negative regulator of Streptomyces differentiation)进行了研究。通过PCR-targeting的方法对耐热链霉菌的nsdA基因进行了中断,得到相应的突变株。摇瓶发酵结果显示:耐热链霉菌nsdA基因的中断可以提高其酰基化酶的酶活,与出发菌株相比,在摇瓶水平,在相同投料浓度下,nsdA中断株AIV的转化率从82%提高到93%。 本研究还对耐热链霉菌的底物耐受性进行了探索,得到了乙酰脱红霉糖泰乐菌素和一种新的替米考星衍生物。……