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禽类病原体抗原在苏云金芽胞杆菌细胞表面的展示

刘梅

   本研究在国内外首次利用来自苏云金芽胞杆菌的S-层蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面成功展示了禽流感病毒核衣壳蛋白NP和血凝素蛋白HA1以及鸡毒霉形体粘附素蛋白pMGA等禽类病原体抗原,从而为用苏云金芽胞杆菌投递病原体抗原来研制热稳定性禽用口服疫苗探明了科学道路。 1.检测S-层表面展示系统中的受体菌株及载体质粒对小鼠和雏鸡的安全性 为了检测展示系统中的受体菌株苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171和载体质粒pHT304的安全性,将质粒pHT304电转化入BMB171中,得到菌株BMB304。以BMB304作为受试菌株,对小鼠和雏鸡进行安全性测试,并考察BMB304在鸡肠道中的存留情况,以探索用苏云金芽胞杆菌无晶体突变株作为外源抗原的载体以研制疫苗的可行性。 小鼠腹腔一次性注射含10~(10)BMB304营养细胞液1.0mL,观察14天,未发现有急性毒性反应。小鼠饮用含10~8、10~7和10~6BMB304营养细胞/mL的饮用水28天,各组小鼠精神和饮食正常,病理解剖学检查未发现异常变化,各剂量组小鼠体重变化、脏器系数、血常规指标及血液生化指标与对照组相比无显著性差异。雏鸡24小时内灌服含10~(10)BMB304芽胞液1.0mL,14天内未出现急性毒性反应。饲喂雏鸡含10~8、10~7和10~6 BMB304芽胞/g饲料28天,雏鸡精神和饮食正常,病理解剖学检查未见任何异常,各剂量组的日增重与对照组相比差异不显著。饲喂雏鸡含10~6BMB304芽胞/g饲料3天后,经测定,芽胞能在鸡肠道中萌发并至少存留5天但不超过7天。结果表明,受体菌株BMB171和载体质粒pHT304对小鼠和雏鸡安全无毒,且能在鸡肠道内暂时定殖,能作为外源抗原的载体以研制疫苗之用。 2.构建含禽类病原体抗原基因的S-层融合蛋白基因 通过PCR扩增分别得到欲展示的病原体抗原基因np、npp、ha1p和pmga1.2p。用抗原基因片段替换S-层蛋白ctc基因表面锚定序列slh下游的3’-端或中部片段,分别获得了2个含np基因的重组质粒pSNP和pCSA-SNP;2个含npp基因的重组质粒pCTC-NPP和pCSNPP;2个含ha1p基因的重组质粒pCTC-HA1P和pCSHA1P;2个含pmga1.2p基因的重组质粒pCTC-PMGA1.2P和pCSPMGA1.2P。其中在构建pCSA-SNP、pCSNPP、pCSHA1P和pCSPMGA1.2P这4个重组质粒时,在S-层融合蛋白基因的上游插入了csaAB操纵元,csaAB操纵元对S-层蛋白锚定到细胞表面起重要作用。 3.构建含S-层融合蛋白基因的重组菌株 将重组质粒电转化入受体菌株BMB171中,分别获得了5个展示NP蛋白的重组菌株BN(含pSNP)、BCN(含pSNP和pMIL-CSA)、C-S(含pCSA-SNP)、BCCN(含pCTC-NPP和pMIL-CSA)和CN(含pCSNPP);2个展示HA1蛋白的重组菌株BCCH(含pCTC-HA1P和pMIL-CSA)和CH(含pCSHA1P);2个展示pMGA蛋白的重组菌株BCCG(含pCTC-PMGA1.2P和pMIL-CSA)和CG(含pCSPMGA1.2P)。其中质粒pMIL-CSA携带有csaAB操纵元,在转化不含csaAB操纵元的重组质粒时要同时转化该质粒,以便给受体菌株提供csaAB操纵元。 4.检测外源抗原蛋白在重组菌株细胞表面的展示情况 用玻片凝集试验检测5个展示NP蛋白的重组菌株的表面展示情况,用血凝和血凝抑制试验检测2个展示HA1蛋白和2个展示pMGA蛋白的重组菌株的表面展示情况。结果,所有的重组菌株均表现出了预计的生物学活性,说明所构建的S-层融合蛋白基因在受体菌株中得到表达并展示到了细胞表面且具有活性。 5.检测重组菌株对小鼠和雏鸡的免疫原性 用9个重组菌株的营养细胞分别通过腹腔注射途径免疫SPF级BALB/c小白鼠,用间接ELISA测定小白鼠血清抗体效价。结果,小鼠产生了针对相应外源抗原的抗体,其抗体水平与作为对照的受体菌株BMB171相比差异极显著,说明所构建的重组菌株具有免疫原性。 将展示HA1蛋白的重组菌株BCCH和CH以及展示pMGA蛋白的重组菌株BCCG和CG培养至芽胞形成期,用重组菌株的芽胞液通过口服途径免疫艾维因商品代肉雏鸡,用血凝抑制试验测定接种BCCH和CH的鸡的血清抗体效价,用血清平板凝集试验测定接种BCCG和CG的鸡的血清抗体效价。结果,实验鸡产生了针对相应外源抗原的抗体,其抗体水平与作为对照的受体菌株BMB171相比差异极显著,说明所构建的重组菌株对鸡具有一定的免疫原性。 在所构建的重组菌株中,CN(含融合基因csa-ctc-npp)、CH(含csa-ctc-ha1p)和CG(含csa-ctc-pmga1.2p)表现出了最高免疫原活性,故本研究寻找到了S-层融合蛋白基因的最佳构建方式csa-ctc-*(*代表外源抗原基因),即用外源抗原基因替换ctc基因的中部,并将csaAB操纵元构建于ctc基因的上游与ctc基因存在于同一个重组质粒中。……   
[关键词]:S-层表面展示;苏云金芽胞杆菌;禽类病原体抗原;小鼠;雏鸡;安全性;热稳定性疫苗
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中农业大学2006年