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梅山×大白F1代与其亲本梅山猪背最长肌间差异表达基因的克隆鉴定及特征分析

谢红涛

   骨骼肌是动物体内最丰富的组织,其生长发育相关性状是肉用家畜最重要的性状之一。两个具有不同遗传基础的亲本杂交产生的后代在生长发育和肌肉品质等方面往往超过其双亲,产生杂种优势现象。为了更好的解释和利用杂种优势,人们提出了很多假说,但是都不能很好的解释杂种优势现象。随着分子生物学的发展,人们已经认识到杂种优势是基因差异表达的结果。 本研究以猪背最长肌为材料,利用抑制消减杂交技术构建了梅山猪及其杂交F1代梅大猪背最长肌间的正反向消减cDNA文库,进行了差异表达基因的筛选、克隆和鉴定,取得了如下结果: 1、以猪管家基因G3PDH作为消减指标,对每个消减文库的消减效率进行了检测,结果表明2个消减文库的消减效率都达2~(10)倍以上,有的甚至高达2~(15)倍,这表明某些在梅山猪及其杂交F_1代梅大猪背最长肌组织中的差异表达基因的富集效率也达2~(10)倍以上,说明所构建的消减cDNA文库质量很好。 2、在每个文库中随机挑选了600多个克隆进行PCR鉴定。在以梅山猪为Tester、梅大猪为Driver和以梅大猪为Tester、梅山猪为Driver的消减cDNA文库中我们分别获得了591和632个有效阳性克隆,插入片段长度主要分布于150—750bp之间。 3、利用斑点杂交技术,以正向消减cDNA、反向未消减cDNA为探针对2个消减cDNA文库中的阳性克隆进行了高通量筛选。在以梅山猪为Tester、梅大猪为Driver的消减cDNA文库中,我们选取了27个差异表达克隆进行分析,发现共代表14个ESTs,4个在猪中为已知基因,10个在猪中为未知基因(其中7个与人等其他物种的基因有高相似性,3个未找到明显的相似性)。在以梅大猪为Tester、梅山猪为Drivcr的消减cDNA文库中,我们选取了20个差异克隆进行分析,发现共代表11个ESTs,其中1个在猪中为已知基因,2个未找到明显的相似性,8个在猪中为未知基因,但分别与人等其他物种的基因有高的相似性。并利用含内标化的半定量RT-PCR对其中一些ESTs进行了验证,大部分为差异表达。 4、将电子克隆、SMART技术和比较基因组学相结合,成功克隆了4个差异表达基因的全长和1个基因的编码区全长cDNA序列:①肌球蛋白轻链调控蛋白2(Myosin Regulatory Light Chain 2,MRLC2),GenBank登录号DQ490129,cDNA全长990bp,ORF为519bp;②造血干细胞因子117(Hematopoietic Stem/Progenitor Cells,HSPC117),GenBank登录号DQ508263,cDNA全长2015bp,ORF为1518bp;③(Bridging Integrator 1,BIN1),GenBank登录号EF117688,cDNA全长2001bp,ORF为1305bp;④Ras癌基因(H-Ras/N-Ras/K-Ras family,N-Ras),cDNA长986bp,ORF为570bp,GenBank登录号DQ325522;⑤肌肉磷酸化酶(Glycogen phosphorylase,muscle form,PYGM),GenBank登录号DQ508264,cDNA全长2843bp,ORF为2529bp。其中MRLC2和HSPC117在梅山猪中表达量高于梅大猪,BIN1、N-Ras和PYGM在杂种F1代梅大猪中表达量较高。 5、利用ORF Finder、GENSCAN、Signal P3.0、ProtParam、Prosite、MEGA等软件对猪MRLC2、HSPC117、、BIN1、N-Ras和PYGM基因的编码区、结构、蛋白质位点及其功能进行了分析,并构建了物种间系统进化树。 6、利用半定量RT—PCR技术对所获得的差异表达基因进行了不同组织(背最长肌、脂肪、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、子宫、卵巢和睾丸)间的表达分析。 7、利用比较基因组学和PCR技术,扩增了猪BIN1、N-Ras和PYGM等3个基因部分基因组序列,分析了其在不同猪种中的多态性,并在大白×梅山F2中与性状进行了相关分析,结果发现,猪肌肉磷酸化酶基因PYGM125位点AA基因型的活体瘦肉率比BB基因型高3%,肥肉率低5%,提示该位点可能是一个比较好的分子标记。……   
[关键词]:;背最长肌;抑制消减杂交;SMART RACE;差异表达;克隆
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中农业大学2006年