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尼罗罗非鱼性别决定机制和性别相关的分子标记

杨东

   尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)已成为世界性的主要养殖对象之一,研究表明其遗传性别决定类型为XX/XY型。对不同遗传型尼罗罗非鱼的有丝分裂中期相染色体进行荧光原位杂交表明,在尼罗罗非鱼中,X与Y染色体之问存在差异。但是到现在为止,没有发现性别特异分子标记。遗传性别的快速鉴定问题是尼罗罗非鱼性别控制研究中的一个难点。本文从DNA水平对雌雄尼罗罗非鱼进行比较,研究其性别控制机理,筛选能区分雌雄的分子标记。主要研究结果如下: 1.本文参照不同物种DM结构域设计了一对兼并引物,以尼罗罗非鱼精巢RNA为模板,通过RT-PCR方法,扩增出一条带,长约140bp。对扩增产物进行克隆,阳性克隆采用SSCP分析筛选不同基因片段,进一步对筛选的不同基因进行了DNA测序。结果获得2个不同的Dmrt基因,与GenBank联机,采用BLAST方法与人类相应DMRT基因进行序列比对,发现与人类相应DMRT基因的氨基酸序列一致性分别为:89.1%、100%,显示出Dmrt基因在系统进化上具有高度的保守性。根据尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的拉丁文名,按习惯将其命名为onDmrt1,onDmrt2。为了探讨Dmrt1和Dmrt2两个基因的功能,根据获得的序列,分别设计一对特异引物,采用RT-PCR技术,对尼罗罗非鱼不同组织Dmrt1和Dmrt2基因的表达进行了研究。结果发现Dmrt2基因在精巢,卵巢,脑,眼,鳃,心脏中都有表达,暗示Dmrt2基因的功能可能主要是参与器官发育,而不是性别决定过程。而Dmrt1只在精巢中特异表达,在其它组织中无表达,显示Dmrt1基因主要在性别决定及性状维持中有重要功能。根据扩增出的Dmrt1 DM-domain的序列,设计上游引物P5,P6,用3‘RACE(rapid amplification of cDNA ends)法从尼罗罗非鱼精巢中分离和测定了Dmrt1 cDNA的序列,3’-RACE扩增得到1108bp的片段,共编码262个氨基酸,奥利亚罗非鱼、虹鳟、新月鱼、青鲻等动物的Dmrt 1的氨基酸序列进行比较,同源性分别为:99%,62%,73%,41%。以Dmrt 1基因组序列为基础,采用Garnier-Robson方法、Chou-Fasman方法和Karplus-Schulz方法预测蛋白质的二级结构;按Kyte-Doolittle方案、Emini方案和Jameson-Wolf方案预测DMRT1蛋白的B细胞表位,为精确地研究DMRT1蛋白的结构和功能,从而揭示他们的性别调控机能提供参考。 2.参照人SRY基因HMG-box保守区序列,设计一对兼并引物,采用PCR技术扩增了尼罗罗非鱼Sox基因,在雌雄尼罗罗非鱼个体中均扩增出五条带,大小分别约为200 bp,400 bp,600 bp,800 bp,1200bp,回收200bp左右扩增产物进行克隆,阳性克隆采用SSCP分析,筛选不同基因片段。进一步对筛选的不同基因进行DNA测序,结果获得了五个不同的228bp Sox基因,与GenBank联机,采用BLAST方法与人类相应SOX基因进行序列比对,发现其与人类相应SOX蛋白的氨基酸序列一致性分别为97.2%、97.2%、94.4%、96%、88.2%,显示出该基因在分子进化上具有高度的保守性。根据尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的拉丁文名,按习惯将其命名为onSox1a、onSox1b、onSox3、onSox4 and onSox12。采用RT—PCR技术,研究了尼罗罗非鱼精巢、卵巢、脑、眼、鳃和心脏等组织中Sox3基因的表达。结果显示,Sox3基因在精巢、卵巢、脑和眼中有不同程度表达,而在鳃和心脏中无表达,,证实Sox3基因在其中枢神经系统的发育,性腺发生和功能维持上有着重要功能。本研究为探索尼罗罗非鱼的性别决定机制和Sox基因表达模式提供了资料。 3.采用RAPD技术对尼罗罗非鱼雌、雄各11尾个体共22个样本进行性别和遗传多样性检测。从80个寡聚核苷酸随机引物中筛选出17个扩增重复性好、条带清晰、特异性强的引物,对每个个体基因组DNA进行了扩增。得到RAPD产物的分子量在200-2000bp之间,产物总计127个位点,其中,多态位点45个(占35.43%)。计算个体间遗传相似系数平均为0.8648,个体间遗传距离平均为0.1352。用Shannon多样性指数量化的遗传多态度(H_0),雄性群体(0.1910)高于雌性群体(0.1797),平均遗传多态度(Hpop)为0.1854。尼罗罗非鱼遗传多态度所占的比例在群体内为13.63%,而雌、雄群体间为86.37%。在尼罗罗非鱼雌、雄个体RAPD产物中,电泳图谱上不能读出明显的雄性特征带。 4.利用AFLP技术,应用49个引物组合,检测了尼罗罗非鱼雌雄基因组DNA的多态性,筛选与尼罗罗非鱼性别相关的分子标记。实验中共扩增出2694条带,筛选出候选差异DNA片段748条。挑选出20对引物进行雌雄两代个体进一步的分析。其中引物E4/M5组合产生1个大小约为150bp的片段,在所有两代雄性尼罗罗非鱼均出现这一片段,在F1代的15尾雌尼罗罗非鱼中有仅有1尾出现该片段,对F2代15尾雌尼罗罗非鱼也只有2出现,由此推断此条带可能与性别相连锁。对该特异扩增带经回收和测序,为了将AFLP标记转化为重复性和特异性更好的SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions)标记,根据序列分析结果,分别合成了一对20碱基特异性引物,用该特异性引物进行PCR扩增,结果雄性有一条SCAR标记,而雌性没有。尼罗罗非鱼的SCAR分子标记能用于筛选全雄品系。……   
[关键词]:尼罗罗非鱼;Dmrt1;Dmrt2;Sox;随机扩增多态性(RAPD);扩增片断长度多态性(AFLP);特征序列扩增区域(SCAR)
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中农业大学2006年