手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

鸡毒霉形体代谢抑制性单克隆抗体的研制及初步应用

杜红霞

   鸡毒霉形体(Mycoplasma gallisepticum,MG)是鸡的慢性呼吸道病(Chronic respiratory disease,CRD)的病原菌。多年来许多国家对MG感染的防制非常重视,但迄今为止仍未找到理想的根除方法。用疫苗作免疫预防是传染病防制的有效手段,但实践中MG疫苗的使用效果并不尽人意。目前,鸡毒霉形体疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗两种,但由于灭活疫苗生产成本高,弱毒疫苗存在一定的脆弱性及对非目标鸡群的威胁,这就制约了这两种疫苗的使用。所以,寻找到MG免疫原性强的蛋白质来研制蛋白亚单位疫苗是鸡群MG感染预防和净化的有力保证。霉形体的部分抗体可抑制霉形体的生长代谢,这一点与病毒的中和抗体类似。因此,代谢抑制性单克隆抗体所针对的菌体蛋白,理论上应该是MG菌体抗原中的主要保护性抗原,本研究为了探索MG菌体抗原中,哪些是具有免疫保护性的MG蛋白抗原,拟制备针对MG的特异性单克隆抗体,通过代谢抑制试验来筛选在体外能抑制MG代谢的单克隆抗体,再以筛选出的代谢抑制性单抗确定MG抗原性蛋白,为MG表达蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。本研究的主要内容及结果如下。 1.鸡毒霉形体MG-S_6单克隆抗体的研制 以MG-S_6菌体悬液为抗原,按照一定的免疫程序免疫6周龄的BALB/c小鼠,将制备的免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。经三次细胞融合,以间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,对阳性杂交瘤细胞进行多次克隆最终获得24株针对MG-S_6的特异性单克隆抗体。经检测这些单抗腹水及细胞培养上清的间接ELISA效价分别在1.00×10~3~2.05×10~6和2.00×10~1~2.56×10~3之间;获得的杂交瘤细胞的染色体数目在79~95之间;从24种单抗中选出11种抗体效价较高的单克隆抗体腹水并测定其相对亲和力。结果表明,单抗1086b株杂交瘤细胞所分泌单抗具有50%OD_(450)值的稀释度最高,浓度最低,即与MG-S_6全菌体抗原的亲和力最高,其次为3G4b、1086a、1086c、1688a、1688b、3G4a、16G9a、16D5、16G9b和1684b。 2.鸡毒霉形体代谢抑制性单克隆抗体的筛选及其抗抗原表位分析 以本研究制备的24株单克隆抗体对1000CCU的MG-S_6菌液分别进行代谢制试验,经三次重复试验,筛选到11株对MG-S_6有明显代谢抑制作用的单克隆抗体将11株单克隆抗体分别与MG-S_6全菌体抗原SDS-PAGE电泳分离条带进行Western-blot反应,结果183和3G4b单抗与56KD蛋白反应;16D5与105KD蛋白反应;1086b、1688b与64KD蛋白反应;7G9a、7G9b、17C5a、16G9a与42KD蛋白反应;17C5b出现了三条显色带分别在105KD、66KD和41KD的位置;16H6b出现了两条显色带,分别在42KD和29KD的位置。根据本试验结果,初步可判断MG-S_6中105KD、66KD、64KD、56KD、42KD、41KD、29KD蛋白有较强的免疫原性,说明代谢抑制性单克隆抗体所对应的菌体抗原不是一类抗原,他们在菌体表面存在多样性,预示着今后我们制备基因工程疫苗,应该选取尽可能多的抗原蛋白作为免疫原,才能达到更好的免疫效果。……   
[关键词]:鸡毒霉形体;单克隆抗体;代谢抑制试验;Western-blot
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2007年