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鸡毒霉形体HS株TM-1和mgc3基因的表位预测及原核表达

郝卫芳

   鸡毒霉形体(Mycoplasma gallisepticum,MG)是鸡慢性呼吸道疾病的病原菌,世界各地均有MG的感染和流行,虽然不直接引起禽的大规模死亡,但疾病的慢性、迁延性流行过程可引起产蛋率下降、孵化率降低、出栏期延长及饲料利用率降低,每年给世界养禽业造成了巨大的经济损失。 目前MG的诊断方法主要有病原的分离鉴定、血清平板凝集试验、PCR和EHSA等方法,但上述方法由于耗时或操作复杂或需要昂贵仪器等缺点,难以在基层推广应用,因此MG新型的快速诊断也成为该病急需解决的问题之一。胶体金免疫层析快速检测MG的方法简便、快速、直观,但是研制抗不同抗原表位的单克隆抗体是该方法建立的重要前提。本研究对MG菌体保护性蛋白TM-1和mgc3基因的表达及抗原表位进行了探讨,旨在为ELISA方法、胶体金免疫层析法快速检测方法及基因工程抗原疫苗的研制提供理论依据,主要展开了以下研究。 1.鸡毒霉形体保护性抗原基因TM-1和mgc3的克隆 参照NCBI收录的TM-1和mgc3基因序列设计引物,以MG基因组为模板,扩增出TM-1和mgc3,经测序,所获得的TM-1基因为819bp;mgc3基因为3186bp。 2.TM-1和mgc3基因序列的分析及抗原表位的预测 TM-1基因测序结果在NCBI数据库中BLAST比对,与S6株同源性为99%,其中103-134bp和135-166bp为重复序列,抗原表位及二级结构的预测参数综合分析,该重复区具有强抗原表位活性;与R株有两个同源性序列,同源性分别为91%和93%。对mgc3基因的全基因序列BLAST比对,得到三条同源性达99%的序列,此外还有三条序列只与mgc3基因的1-1300bp具有同源性,分别是99%、98%和91%。选取了HS株的mgc3基因1000-3186bp的区域进行抗原表位软件预测,得到1142-1440bp、1704-2169bp、2165-2521bp和2507-2835bp区域具有较强的抗原活性。它们不仅亲水性、表面可及性、抗原性参数较高,而且每段序列的上下游引物都包含了该区的所有突变位点;MG-HS株的mgc3基因中还有10个编码色氨酸TGA的位点。 3.鸡毒霉形体TM-1和mgc3基因抗原表位区的原核表达及其活性鉴定 将经过分析的含有高免疫活性的目的片段亚克隆到表达载体pGEX-KG,经转化、诱导后获得表达蛋白,SDS-PAGE分析表明融合表达的蛋白分子量分别约为55KDa、37KDa和44 KDa。Western blot印迹证明表达蛋白均具有免疫学活性。说明表达蛋白可用于免疫诊断和也为基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。……   
[关键词]:鸡毒霉形体;TM-1;mgc3;保护性抗原;抗原表位
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2007年