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细菌对磺胺类药物耐药基因三重PCR检测试剂盒研制与应用

周万蓉

   为了建立特异、灵敏、快速的细菌磺胺类药物耐药基因检测技术,指导临床用药,为控制耐药菌株的传播提供有力的手段,本研究根据GenBank提供的序列,分别设计了针对Sul1、Sul2和Sul3三个基因的3对特异性引物,利用三重PCR技术研制了细菌磺胺类药物耐药基因的检测试剂盒,并进行了初步应用。 利用单基因PCR扩增技术,筛选出阳性扩增菌株FJ504,扩增产物纯化测序后与GenBank上公布的Sul基因序列进行同源性比较,其同源性均达到98%以上。以FJ504为PCR检测试剂盒的阳性对照,药敏质控菌ATCC25922为阴性对照,探索三重PCR反应条件,并对反应体系进行了优化,筛选了最佳的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度和引物浓度,选定了最适的退火温度和循环次数,并建立了快速灵敏的模板制备方法。优化后的反应体系和反应参数为:反应总体积为50μL,其中10×PCR buffer 5μL,MgCl_2(25 mmol/L)5μL,dNTP(2.5 mmol/L)4μL,Sul1基因、Sul2基因和Sul3基因的特异性上下游引物(25μmol/L)分别1.4μL、0.4μL、1.2μL,Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)0.35μL,模板5μL;反应参数:预变性94℃5min,变性94℃50 s,退火55℃45 s,延伸72℃50 s,32个循环,72℃终止延伸6 min。 在三重PCR反应体系优化完成的基础上,组装了三重PCR检测试剂盒,并对已测序鉴定的阳性菌株进行扩增,均可扩增到特异性条带;而对大肠杆菌标准菌株、葡萄球菌标准菌株、鸡传染性支气管炎病病毒(IBV)、兔瘟病毒的核酸样品等对照样品扩增,PCR结果均为阴性,说明该试剂盒特异性强。用试剂盒检测不同稀释度的阳性样品,其检测灵敏度可达到2×10~4cfu/mL,说明该试剂盒灵敏性高。试剂盒批间和批内重复性试验结果表明,该试剂盒具有良好的重复性。同时,本试剂盒在含引物但不含Taq酶的情况下可4℃保存四个月,-20℃条件下保存五个月。 对50株随机选取的菌株,同时进行药敏试验和试剂盒检测,结果显示,本试剂盒与常规药敏试验的符合率可达90%。同时,本试剂盒还具有反映细菌的隐性耐药性的优势。 利用本试剂盒对来源于我国24个省(市)约730株细菌(规模化猪、鸡场大肠杆菌和沙门氏菌,四川地区牦牛、奶牛、兔以及野生动物肠道分离菌)进行了检测,结果表明,不同来源动物、不同年代以及不同种属的动物源细菌磺胺类药物耐药基因分布存在很大的差异,猪、鸡源细菌的检出率分别高达79.2%和77.1%,而牦牛和野生动物源细菌的检出率则分别只有36.4%和20.8%;大肠杆菌、沙门氏菌和葡萄球菌,其sul基因的检出率分别达到83.2%、68.0%和73.8%。在70年代,大肠杆菌sul基因的检出率仅有30.0%,而到2004年以后,其sul基因的检出率却高达70.9%,增加了近1.5倍。由此可见,本试剂盒能准确检测动物源细菌对磺胺类药物的耐药性,反映出耐药基因的检出率呈不断上升的趋势。 本研究研制的多重PCR检测试剂盒具有灵敏、特异、快速的优点,为我国动物源细菌磺胺类药物耐药基因的检测及流行病学调查提供了新的技术手段,在国内尚属首次报道。……   
[关键词]:磺胺类药物;耐药基因;三重PCR;试剂盒
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川农业大学2007年