手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

猪圆环病毒Ⅱ型ORF1、ORF3及ORF5基因部分功能的研究

杨晓农

   猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,目前尚无有效的疫苗防制该病。PCV2的全基因组为1767~1768bp,可能含11个阅读框架,其中的许多读框架的功能仍不十分清楚。本研究从病料中直接扩增PCV2全基因组并进行克隆,采用酶切缺失方法分别构建ORF1、ORF3、ORF5基因缺失突变毒株,通过PCR检测、PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)以及透射电镜观察,鉴定其对IBRS-2细胞的感染性,并进行动物接种试验,研究其对仔猪的致病性及免疫原性。目的是为研究上述基因的功能,探讨其对病毒复制能力及致病力的影响,同时为构建新型基因工程疫苗候选毒株提供新的方法和理论依据。 设计了一对特异性引物(AF-P1/AF-P2),并引入便于后期操作的SacⅡ酶切位点。从成都地区某猪场送检的,经多重PCR方法检测为PCV2阳性的病料中一次性扩增获得了1767bp的PCV2全基因组(命名为:PCV2-CD)。将其克隆到pMD18-T Simple载体上,构建了重组质粒pMD18-T Simple-PCV2-CD,并进行了酶切鉴定和测序鉴定。核苷酸序列分析表明:PCV2-CD株与Genbank中公布的其它12个PCV2毒株间的同源性高达95.0%~100%。 采用EcoRⅤ、BragBⅠ双酶切重组质粒pMD18-T Simple-PCV2-CD,缺失碱基187bp,获取4272bp目的线性DNA片段,回收平端连接环化构建了ORF1基因缺失重组质粒pMD18-T Simple-PCV2-CD-A;分别采用NcoⅠ和BstBⅠ单酶切pMD18-TSimple-PCV2-CD获取4459bp线性目的DNA片段,补平、连接环化分别构建了ORF3、ORF5基因插入缺失重组质粒pMD18-T Simple-PCV2-CD-C和pMD18-TSimple-PCV2-CD-E。新构建的3个基因缺失重组质粒经酶切鉴定及测序鉴定均证实构建正确。用SacⅡ酶切重组质粒pMD18-T Simple-PCV2-CD-A、pMD18-T Simple-PCV2-CD-C和pMD18-T Simple-PCV2-CD-E,获得基因缺失后的PCV2-CD的线性基因组。分别回收1580bp、1771bp和1769bp的目的片段,经体外连接环化构建了ORF1、ORF3、ORF5基因缺失突变毒株mPCV2-A、mPCV2-C、mPCV2-E。三个基因缺失突变毒株分别用脂质体转染法转染IBRS-2细胞(PCV1和PCV2检测阴性)培养并盲传。经PCR检测、PCR-RFLP分析,在分别转染后培养并盲传4代的细胞中,特异性地检测到mPCV2-A、mPCV2-C、mPCV2-E的DNA,并能与亲本毒株PCV2-CD相区别;电镜观察发现,培养、盲传6代的IBRS-2细胞胞核或胞浆中存在PCV2各缺失突变毒株的病毒颗粒。鉴定结果表明,构建的3个PCV2基因缺失突变毒株mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E具有感染性,能够在IBRS-2细胞中复制增殖。发现ORF5基因、并证实ORF3基因不是PCV2复制的必需基因;ORF1中187bp的缺失对PCV2的复制未产生明显的影响。 24头28~30日龄健康仔猪(PCV1、PCV2检测为阴性),随机分成5组。其中,A、B、C组为试验组(5头/组),各组每头分别肌肉注射mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E细胞培养物2ml;D组为PCV2-CD对照组(5头),每头肌肉注射PCV2-CD细胞培养物2ml;E组为阴性对照组(4头),每头肌肉注射生理盐水2ml。A、B、C、D四个组中各有一头猪在接种后10d(10DPI)进行屠宰,采集组织器官用于病毒在体内复制增殖的检测及组织病理学观察;分别于接种后第0d、7d、14d和21d采集试验猪前腔静脉血进行T淋巴细胞亚群以及PCV2抗体的动态检测,数据用DPS v6.55统计分析软件进行处理。结果表明:用已建立的PCR和PCR-RFLP方法,分别从各试验组接种后10天(10DPI)屠宰仔猪的腹股沟淋巴结中特异性检测到基因缺失突变毒株DNA,发现基因缺失突变毒株mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E能够在仔猪体内复制增殖,基因缺失突变未影响病毒在机体内的复制增殖。组织病理学观察表明,三个试验组(mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E组)屠宰仔猪淋巴结显现次级淋巴小结数量减少和/或生发中心的扩大,肝细胞出现颗粒变性和水泡变性,肺泡壁上皮细胞肿胀并见淋巴细胞浸润,脾脏、肾脏和心脏组织未见病理变化;PCV2-CD组的病变较严重。基因缺失未改变突变毒株的组织侵蚀途径,并显示基因缺失可导致病毒致病力的降低。用流式细胞仪(FACS)对外周血中CD3~+、CD4~+及CD8~+ T淋巴细胞亚群百分含量动态检测表明,基因缺失对病毒的细胞免疫功能未产生影响,mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E有诱导仔猪细胞免疫应答的趋势。用酶联免疫吸附法(ELISA)对外周血中PCV2抗体的动态检测发现,基因缺失毒株mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E均明显地诱导了仔猪的体液免疫,具有良好的免疫原性,基因缺失对病毒的体液免疫功能未产生影响。基因缺失毒株mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E可作为PCV2基因缺失疫苗的候选毒株。……   
[关键词]:猪圆环病毒II型(PCV2);基因功能;ORF1基因;ORF3基因;ORF5基因
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:四川农业大学2007年