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松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)对温度胁迫适应的分子生态机制研究

戴素明

   松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是一种世界多国公认的重大外来入侵生物,可引起松树大量死亡,危害严重。其原产地在美国,现已广泛在北美和亚洲的多个地区分布。随着人类活动对自然界影响的日益加剧,外来生物入侵已成为全球关注的问题。从原产地到传入地,外来生物面对的生态环境必然有所不同。对于环境中的限制因素,外来生物如何发挥自身的生物潜力,是其在新栖地形成入侵的关键。因此,有必要从环境因子入手研究松材线虫本身的抗逆性及其生态适应性机理,可揭示其成功入侵的内在机制,对于理解该种外来生物的入侵过程以及开展防治工作将具有重要意义。本研究从重要的生态组成因子—温度入手,分析松材线虫在低温和高温胁迫下的耐寒性和耐热性。在此基础上,从生理生化和分子水平上探讨松材线虫的耐热性机制。同时,运用RNAi技术,对松材线虫的热激蛋白70基因和纤维素酶基因(Bx-eng-1)的功能做了进一步探讨。本研究首次较系统、深入地对松材线虫的生态适应性机制进行了研究,其研究结果填补了国内外对松材线虫有关研究的空白。主要研究结果如下: 1.分别在低温和高温两种逆境环境中,分析了松材线虫的适应能力。结果表明:松材线虫雄虫经受4℃低温两天后仍能100%存活,但在零下低温环境中短暂暴露后发生大量死亡,其耐寒性表现为寒冷敏感型;比较种群的耐热性,松材线虫的耐热力明显比拟松材线虫强,且其耐热力在我国各地理种群之间出现了分化;驯化能够增强松材线虫的耐热力,通过热激2-3小时,线虫的高温存活率是对照的4倍左右。由此,为深入研究松材线虫温度逆境适应机制提供了参考指标。 2.建立了松材线虫海藻糖分析方法;从生理生化水平,通过测定线虫体内海藻糖含量的变化,探讨松材线虫对温度逆境的适应机制。结果表明:海藻糖含量与高温存活率不呈正向关系,由此说明海藻糖可能与松材线虫的耐热性无关。 3.热激蛋白70(Hsp70)是已知热休克蛋白家族中最重要的一种,它在细胞内的大量表达可以明显改善细胞的生存能力,提高对环境胁迫或伤害的耐受性。采用RACE-PCR技术,从松材线虫中克隆了Hsp70基因的全长cDNA序列(共2061bp)(GenBank登录号为:DQ785812)。其编码一个分子量为70kD的642个氨基酸的蛋白序列,含有三段Hsp70家族的签名序列。同源性分析表明,氨基酸序列与其它真核生物的Hsp70序列具有很高的相似性,并与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)热激蛋白70家族中的hsp-1基因编码的氨基酸序列更为相似。因此,将克隆的松材线虫Hsp70基因命名为Bx-hsp-1。构建了一个原核表达载体Bx70pEASY-El,当IPTG终浓度为0.4-0.8mmol/L时,能诱导表达融合蛋白。Bx-hsp-1的克隆和表达,为下一步研究松材线虫的生态适应性机理奠定了基础。 4.从原核生物角度分析Bx-hsp-1的特性,发现表达Bx-hsp-1的原核细胞明显比对照耐受高温胁迫。结合松材线虫热激反应现象,我们利用实时荧光PCR技术分析该基因在松材线虫受到不同温度预处理后的表达动态,发现Bx-hsp-1的表达随着热激时间的延长呈上升趋势(2—3倍的增加)。由此解析了Bx-hsp-1是松材线虫适应高温的机制之一。进一步利用交叉干扰技术解析Bx-hsp-1在正常生物体内的生理功能,发现Hsp70对线虫的胚胎发育和迁移活动起着一定作用。 5.RNAi是研究基因功能的重要方法。首次将RNAi应用于松材线虫,分析体外鉴定具有纤维素酶活性的Bx-eng-1的dsRNA干扰表型。结果显示,和已有的植物寄生线虫RNAi研究不一样,松材线虫在非寄生状态下无需神经剂(章鱼胺)也具有吞噬行为。经过24小时的浸泡,dsRNA有效地进入线虫体内,使Bx-eng-1发生转录后沉默以及线虫体内纤维素酶活性的减弱。在此过程中,摇床的悬浮作用对发挥浸泡法的最大优势起着重要作用。RNAi表型分析发现,Bx-eng-1的沉默使得松材线虫的发育能力和耐热力都发生了减弱。由此,从致病基因角度解析了其在松材线虫耐受高温胁迫中的作用。……   
[关键词]:松材线虫;耐寒性;耐热性;海藻糖;Bx-hsp-1;Bx-eng-1;RNAi
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:湖南农业大学2007年