手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

李氏溶血素单克隆抗体制备及检测李氏溶血素的初步探索

秦玉敏

   单核增生性李斯特杆菌(Listeria Monocytogenes,LMO)是一种重要的人畜共患食源性疾病致病菌,可引起人和动物的脑膜炎、败血症等疾病,病死率非常高。李氏溶血素(Listeriolysin O,LLO)由LMO分泌,是LMO特有的毒力因子,在其感染机体的过程中,发挥极为重要的作用。本实验以原核表达系统pGEX-6P-hly/BL-21表达的重组LLO,经纯化作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,以LMO—0586于BHI培养基中分泌的天然LLO为筛选抗原,检测抗LLO单克隆抗体。经过细胞融合,建立间接ELISA方法,采用有限稀释法,经三次亚克隆,获得6株稳定分泌抗LLO单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为ⅠF5、ⅡC4、ⅡE5、ⅢG7、ⅣB7、ⅣE9。 经亚类鉴定其中ⅠF5、ⅡC4、ⅣE9、ⅡE5分泌的单克隆抗体为IgG1型,ⅣB7、ⅢG7分泌的单克隆抗体类型为IgM型,所有都是κ链抗体;杂交瘤细胞染色体数目平均在85-103条;间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价ⅠF5、ⅡC4为1:512,ⅣE9、ⅣB7、ⅢG7为1:256,ⅡE5细胞培养上清效价为1:128;以分泌性较好的ⅡC4细胞株大量制备腹水单抗,经检测其效价为1:10~5,Western blot检测该单克隆抗体具有很好的反应特异性;阻断ELISA检测溶血素实验发现此单抗对天然李氏溶血素有较好的结合能力,不与葡萄球菌、链球菌、丹毒杆菌所分泌的溶血素结合,说明所制备的抗重组LLO单克隆抗体对病原检测具有高度的特异性。 本研究还以纯化的重组LLO包被ELISA微量反应板,以制备的腹水单抗为诊断抗体,然后用此诊断抗体分别与BHI培养基和TSB-YE培养基培养的不同时段的LMO上清发生反应,初步在实验室建立了阻断ELISA检测LMO的方法。使用TSB-YE培养基,其检出时间和检菌限值分别为增菌后5h和9.5×10~5个/ml,使用BHI培养基其检测时间和检菌限值分别为增菌后5.5h和2.7×10~6个/ml,实验中还发现从不同培养基繁殖细菌效果看,相同的培养时间BHI培养基的增菌数要大于TSB-YE培养基,而从细菌产生LLO的能力上看,使用TSB-YE培养基要明显强于BHI培养基,可以更早的检出LMO,这为进一步研制LMO快速检测试剂盒奠定了基础。……   
[关键词]:单核细胞增生性李斯特氏菌;李氏溶血素;单克隆抗体;鉴定;ELISA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:东北农业大学2007年