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乳糖酶产生菌的分离、鉴定及其基因克隆的研究

燕艳

   β-半乳糖苷酶(β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶,β-D-galactoside galatohydrolase,EC3.2.1.23)通常被称为乳糖酶(Lactase)。该酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖,并具有半乳糖苷的转移作用。目前,我国许多成年人和儿童是乳糖缺乏症患者,他们体内缺乏乳糖酶或乳糖酶活性很低。随着社会的向前发展,牛奶逐渐成为人们的主要食品之一,但牛奶中乳糖含量较高,这将制约牛奶的食用量,因此,利用乳糖酶生产低乳糖乳及乳制品是解决乳糖不耐受症问题的最佳途径,具有重要的实践价值和理论意义。 本论文从新疆火焰山土壤中筛选出两株具有胞外乳糖酶活性的菌株,利用分子生物学方法分别对两株菌株进行鉴定,同时克隆了Huob的乳糖酶基因,并在大肠杆菌BL21中进行了表达。 研究内容及结果如下: 1.产乳糖酶菌株的筛选 从新疆火焰山土壤中筛选出的两株菌株分别为Huoa、Huob,并且确立了酶活力测定方法和标准曲线,绘制了在摇床水中菌株Huoa和菌株Huob的酶活生长过程曲线。确定了原始菌株Huoa酶活性最高为0.074 U/mL,菌株Huob酶活性最高达到为0.415 U/mL。并且通过结晶紫染色后利用光学显微镜观察了两种菌的形态。 2.产乳糖酶菌株的分子生物鉴定 通过细菌16srDNA通用引物对两株菌体进行PCR扩增其对应序列,然后对PCR产物进行测序,在GenBank中对比分析了菌株Huoa和菌株Huob同源性较高的菌株,分析鉴定其对应两种细菌的种属。利用Dnaman软件对两种菌的16srDNA进行进化树分析,可知菌株Huoa的16srDNA与Cellulomonas variformis的16S的相似性很高可达到96%,在进化上很可能同属于一个祖先。菌株Huob的16srDNA与Bacillus megaterium的16S亲缘关系最近可达到100%,在进化上很可能同属于一个祖先。 3.乳糖酶基因克隆及原核表达 针对菌株Huob的16SrDNA同源性较高的乳糖酶基因设计引物,克隆其全长的β-半乳糖苷酶基因,经过测序得到乳糖酶全长3246bp和在NCBI中已发表的巨大芽孢杆菌乳糖酶相似性为99%,将此基因命名为BaMeb。然后将此基因转化到原核表达载体PET-30(a)中,构建了重组质粒,实现了β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌BL21中的表达,表达量为7.64U/mL,相对原始菌株提高了乳糖酶的表达量。……   
[关键词]:乳糖酶;菌株筛选;菌株鉴定;基因克隆;原核表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:东北农业大学2007年