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犬干扰素-γ的复性及活性测定

陈忠广

   犬干扰素是治疗犬病毒性疾病的一种有效手段,但以原核细胞表达的干扰素多以包涵体形成存在,为无生物学活性的蛋白质,需要经过体外重薪折叠复性后才能恢复为具有生物活性的干扰素。稀释复性是一种简单快捷的蛋白质复性方法,也是研究其他复性方法的基础。 本实验对表达犬干扰素—γ的pJLA605-CaIFN-γ重组质粒原核表达系统进行诱导表达,对表达后的菌体经溶菌酶作用后,超声波破碎,获得富含重组犬干扰素-γ的包涵体,洗涤后再通过8mol/L尿素溶解,将溶解后的包涵体通过稀释复性法进行复性;探讨了不同折叠促进剂、加样方式、温度、pH值在稀释法复性条件下对重组犬γ-干扰素体外折叠的复性影响;采用MDCK—VSV系统,通过细胞病变(CPE)效应为基础的结晶紫染色法测定复性后重组犬干扰素-γ的活性,用考马斯亮蓝法测定复性后的犬γ-干扰素的浓度。结果表明,每升诱导后的菌体经8mol/L尿素溶解后,得到的包涵体总蛋白为285mg;利用0.5M精氨酸、0.5M盐酸胍、2.0M尿素均能有效抑制复性过程中蛋白质的聚集,其中0.5M精氨酸的效果最好。在4℃、pH值8.0、0.5M精氨酸复性液,蛋白浓度0.15mg·mL~(-1)及脉冲加样操作方式下,复性后重组犬γ-干扰素的活性为1.35×10~4U·mL~(-1),比活达3.74×10~6U·mg~(-1)。……   
[关键词]:重组犬γ-干扰素;稀释复性;折叠促进剂;活性;比活;包涵体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:东北农业大学2007年