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人神经营养素-3成熟蛋白基因的克隆、表达及生物学活性检测

阳燕

   神经营养因子(neurotrophic factors,NTFs)作为促进神经细胞存活、生长、分化的一类分泌型蛋白,一直被人们所关注,主要包括神经营养素家族、胶质细胞源性神经营养因子家族等几大类三十余种蛋白质。神经营养因子通过与其受体结合,激活细胞内信号转导途径,它们具有多种生物学活性,对中枢神经系统中的海马胆碱能神经元、黑质多巴胺能神经元、蓝斑去甲肾上腺能神经元、纹状体GABA能神经元以及外周神经系统中的运动神经元、感觉神经元、交感神经元等多种神经元均有作用,对非神经系统也有一定影响。研究表明,神经营养因子不仅可以减少神经变性,阻止疾病进程,而且还具有刺激轴突生长、促进其再生的功能,极有可能成为未来治疗阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓损伤和外周神经病变等神经系统疾病的重要手段。 神经营养素-3(neurotrophin-3)是神经营养素家族(neurotrophin family,NTs)成员之一,其mRNA在中枢和外周神经系统中广泛表达,两种受体分别为低亲和力受体p75~(NTR)和高亲和力受体TrkB,促进神经元生长、发育、分化和存活,对损伤神经元的修复与再生也有作用。 本实验以人胎脑RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增了人神经营养素-3 cDNA,并将其插入的质粒pGEM-T中,构建了克隆载体pGEM-T-hNT-3。应用酶切和PCR方法对阳性重组子进行了鉴定,并测定了阳性重组子的序列。结果表明,所克隆的入神经营养素-3 cDNA核苷酸序列为35bp,与已发表序列(GenBank MW002527)同源性为99.7%,其编码119个氨基酸。 利用EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点,从克隆载体pGEM-T-hNT-3中得到人神经营养素-3cDNA,并将其与线性质粒pGEX-6p-1相连接,构建了人神经营养素-3原核表达载体pGEX-6p-1-hNT-3。将经酶切和PCR鉴定的阳性重组子转化到宿主菌BL21(DE_3)PlysS中,用IPTG作为诱导剂,以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳观察重组人神经营养素-3融合蛋白在阳性菌的表达情况,并摸索其最佳诱导条件。实验发现,重组人神经营养素-3融合蛋白在37℃和28℃诱导培养时均主要以包涵体形式表达,且在IPTG浓度为1.0m mol/L的条件下,37℃诱导4hr时,重组人神经营养素-3融合蛋白表达量最大;阳性菌诱导表达的融合蛋白分子量分别约为39.6kD,其中谷胱甘肽S-转移酶标签蛋白分子量约为26 kD,人神经营养素-3分子量约为13.6 kD。实验过程中对表达的重组人神经营养素-3融合蛋白包涵体进行了裂解,并采用谷胱甘肽氧化还原系统复性了溶解后的重组人神经营养素-3融合蛋白。用GS4B树脂纯化了重组人神经营养素-3,并对纯化蛋白进行了浓缩。 为了检测所获得的重组人神经营养素-3的生物学活性,进行了体外培养神经元的实验。实验选用了新生24小时内小鼠脑组织,用无血清培养基Neurobasal联合B27添加剂纯化培养神经元。结果表明重组人神经营养素-3具有促进体外培养的神经元突触生长,促进神经元的存活的作用。 本实验在原核表达系统BL21(DE_3)PlysS成功表达了人神经营养素-3,并对重组人神经营养素-3融合蛋白进行了功能分析,为进一步研究它的生物学功能提供了良好的条件,并为研究其在神经系统疾病治疗中的应用奠定了基础。……   
[关键词]:神经营养素-3;原核表达;蛋白纯化;生物活性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:东北农业大学2007年