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野桑蚕的有机磷抗性调查及抗性基因GST-Omega1的融合表达研究

马晓英

   野桑蚕(Bombyx mandarina)属鳞翅目蚕蛾科,和经济昆虫家蚕(Bombyx mori )具有共同的祖先,现在普遍认为野桑蚕的农药抗性大于人工训化过的家蚕,国内外不少学者对家蚕的农药抗性进行了较多的研究,但对野桑蚕的研究较少,筛选出野桑蚕的抗性品种至今未见报道。 本研究以筛选有机磷抗性野桑蚕品种为目的,探讨野桑蚕对有机磷农药的抗性。我们从野外收集野桑蚕,通过添食不同浓度的敌敌畏农药,进行逐代筛选。结果显示:在有机磷农药的压力选择下,野桑蚕对敌敌畏农药的抗性逐代加强,敏感性逐代降低,经过三个世代的筛选,野桑蚕对敌敌畏的最高抗性水平提高1倍,各代的化蛹率也相应提高。初步筛选出的抗性野桑蚕品种为野桑蚕抗性基因的研究提供了较好的材料,同时为鳞翅目害虫的防治和抗性家蚕品种的选育提供了一定的理论数据。 谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)是昆虫体内的一类与抗性相关的初级代谢及次级代谢酶系,该酶系参与有机磷、有机氯和植物次生物质的解毒。 本研究通过RT-PCR从野桑蚕中肠组织细胞中获得GST-Omega1基因的cDNA序列,该基因的ORF为771 bp,编码256 aa;对推导的氨基酸序列用NCBI的蛋白质Conserv -ed Domains工具进行在线分析,结果显示:GST-Omega1的氨基酸序列中具有Cys38和8个GSH结合位点的Omega类基因保守序列;对所获得的GST-Omega1基因在大肠杆菌表达系统进行表达,经SDS-PAGE和Western–blot -ting分析,都能检测到一条分子量约为33 kD的特异性条带,与推导的融合蛋白大小相符,该目的蛋白的表达量占总蛋白的20.6 %。进一步将该基因在Bac-to-Bac系统进行表达,表达的33 kD蛋白,与推导的融合蛋白大小相符,该目的蛋白的表达量占总蛋白的14.4 %;将Bac-to-Bac系统中表达的融合蛋白经His·Bind树脂纯化,以CDNB为底物测定其酶比活性为0.09μmol/(mg·min),用Line weaver-Burk作图法计算Km和Vmax值,结果显示GST-Omega1的Km为2.81μmol/L,Vmax为2.70μmol /(mg·min)。……   
[关键词]:野桑蚕;抗性;谷胱甘肽S-转移酶;基因表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:苏州大学2007年