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大鼠血管平滑肌增殖器官模型的机制探讨

张艳林

   研究目的:探讨大鼠动脉在体外培养条件下其血管平滑肌细胞增殖的形成机制,为本室已建立的血管平滑肌增殖器官模型的应用提供理论依据。 实验方法: 实验分组:在无菌条件下取大鼠腹主动脉,剪成1.5cm左右小段,实验分成:20%FBS培养(其中又分为:内皮损伤、损伤+BQ123、未损伤、未损伤+ BQ123四个组)和无血清培养(其中也分为:内皮损伤、损伤+ BQ123、未损伤、未损伤+ BQ123四个组)共8个实验组。每组10个血管条,分两个培养瓶在DMEM培养基中培养10d,每隔24h半量换液一次。其中一瓶于培养第5天时加入5-Brdu(8×10-4mol/l)标记,收集后用4%多聚甲醛固定,作石蜡切片用于HE染色和免疫组织化学染色。另一瓶用于提取总RNA做RT-PCR。收集每组培养上清贮存于-80℃,用于检测ET-1。正常对照组用未培养的血管。 免疫组织化学染色:每组5个血管条各取2张切片做免疫组织化学,具体步骤如下:将切片脱蜡至水后,用含0.3%双氧水的甲醇封闭;2N盐酸37℃1h;正常羊血清封闭20 min,以上各步之间用0.1M PBS冲洗3次。5-BrDU抗体(1:250)4℃过夜;二抗(1:50)37℃30 min;SABC 37℃20 min;DAB显色3 min,以上各步之间用0.1M PBS冲洗3次。脱水,二甲苯透明,封片,显微镜下观察。每张切片都进行阳性细胞计数,每组阳性标记细胞以X±表示,用X±t检验显著性差异。 上清液中ET-1的测定:将上述收集的培养上清液,使用放射免疫试剂盒和放免检测仪,按照说明书操作测定各组样品中的内皮素含量。每一实验重复3次。结果以X±表示,组间用X±检验显著性差异。 RT-PCR检测:将上述实验收集的血管用一步法(Trizol试剂)提取总RNA,在20μl反应体系中42℃50 min,70℃15 min,逆转录mRNA为cDNA。取逆转录产物3μl加入聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction , PCR)体系,在50μl反应体系中进行聚合酶链反应。聚合酶链反应:94℃变性50 s,56℃退火50 s,72℃延伸1 min,共32个循环。产物经图像处理系统进行分析,同一实验重复3次。 结果: 1.血管平滑肌细胞的增殖:(1)HE染色可见,内皮损伤血管经体外培养10天后平滑肌细胞明显增生,肌纤维排列紊乱。(2)抗5-Brdu免疫组织化学染色显示,各组培养血管中膜均有标记的平滑肌增殖细胞,但内皮损伤后用20%血清培养组标记的增殖细胞明显多于无血清培养组,在培养基中加入内皮素受体阻断剂BQ123能明显抑制血管平滑肌的增殖(P〈0.05)。(3)RT-PCR检测发现,血管平滑肌增殖负调控基因Hrg-1在正常血管平滑肌中都有表达,而各组内皮损伤后体外培养10天的血管表达均明显减弱,血清培养组更为显著,加ET-1特异性阻断剂BQ123后各组表达均明显上调。这说明ET-1分泌及血清刺激对内皮损伤后体外培养的血管平滑肌细胞增殖起了重要作用。 2.血管平滑肌表型的转化:RT-PCR检测发现,血管平滑肌收缩表型标志基因SM22α在正常血管平滑肌中都有表达,但在内皮损伤后体外培养10天的血管表达明显减弱,其中血清培养组血管基本不表达,加内皮素受体阻断剂BQ123后,各组SM22α的表达均有所上调,这表明内皮素分泌和血清培养促进了血管平滑肌的表型由收缩型向分泌型的转化。 3.培养上清中ET-1的变化:内皮损伤后血管ET-1分泌增加,其中血清培养组增加更为显著(P<0.01),加入ET-1受体阻断剂BQ123后,各组ET-1分泌普遍减少,这一结果说明内皮损伤和血清培养条件能促进血管ET-1分泌,而ET-1受体阻断剂BQ123能减弱上述作用。 结论:大鼠主动脉经体外培养能诱导平滑肌细胞异常增生并表型从收缩型向合成型转化,ET-1和血清作用是该模型平滑肌增殖的主要因素。本模型为研究血管平滑肌增殖性疾病的机理和防治提供了一个较好的实验平台。……   
[关键词]:器官模型;平滑肌增殖;机制;表型转化;内皮素-1;血清
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:苏州大学2007年