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NMDA受体-1亚单位磷酸化在新生SD大鼠缺氧缺血性脑损伤中的作用机制

黑明燕

   脑神经细胞N—甲基—D—天冬氨酸(N-Methyl-D-Aspartate,NMDA)型谷氨酸受体的激活在缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic Ischemic Brain Damage,HIBD)的病理生理过程中占据着十分重要的地位。本研究的目的是了解NMDA受体-1亚单位(NR1)磷酸化在新生Sprague-Dawley(SD)大鼠HIBD中的作用机制。 方法:7日龄SD大鼠随机分为正常对照组、缺氧缺血(HIBD)组(HIBD动物模型制作采用右颈总动脉结扎并低氧吸入的方法)和NMDA微量注射组。应用TTC染色了解脑组织损伤大体情况;应用免疫荧光组化染色和Western Blot共同了解NRl、phospho-NR1 S897表达;应用流式细胞仪技术测定各组脑细胞线粒体膜电势(△Ψ_m)变化规律,了解其线粒体受损程度;应用荧光光谱仪进行细胞内游离钙浓度([Ca~(2+)]_i)测定。应用SPSS11.1统计软件进行数据的统计学分析,P<0.05时被认为具有统计学意义。 结果: (1)正常对照组:TTC染色呈红色,免疫组化染色和Western Blot检测均显示脑皮质神经细胞NR1表达呈阴性、而phospho-NR1 S897呈高表达,右侧大脑半球△Ψ_m为(18.21±1.26)MFL,[Ca~(2+)]_i为(559.24±52.36)nmol/L,左右大脑半球△Ψ_m及[Ca~(2+)]_j基本相等。 (2)HIBD组:TTC染色显示HI损伤后12h可观察到白色或粉红色受损脑组织,HI后24h和48h时损伤最严重、其损伤容积与全脑容积比分别为(0.172±0.012)和(0.183±0.017),与正常相比较差异有统计学意义,之后脑组织损伤开始恢复;HI损伤使NR1阳性表达细胞增加,phospho-NR1 S897阳性表达细胞减少,二者发生的部位之间有明显的相对应关系。phospho-NR1 S897的表达在HI损伤后3h-24h之间呈进行性下调,HI损伤后3、6、12和24h的phospho-NR1S897阳性细胞数为(64±19)、(48±16)、(38±15)和(21±8),其中12h、24h阳性细胞数与正常相比较差异有统计学意义(p<0.05);phospho-NR1 S897的Western Blot表达呈进行性减弱,HIBD后6h、12h和24h的发光条带密度值与正常相比分别降低22.2%、65.7%和94.1%,其中HIBD后12h和24h的结果与正常相比差异具有统计学意义(P<0.05);HI损伤侧△_Ψ_m则呈现“降低-恢复-再降低-再恢复-再降低”的改变,右侧:左侧△Ψ_m比值在HI后0、4、24h出现3次降低,分别为(0.80±0.17)、(0.70±0.22)、(0.71±0.13),变化最明显的部位是大脑皮质区;HI损伤侧大脑半球的[Ca~(2+)]_i为(789.64±55.78)nmol/L,明显高于正常新生鼠且差异具有统计学意义(P<0.05)。 (3)NMDA微量注射组:注射后0-4h内TTC染色均大致正常;免疫组化染色、[Ca~(2+)]_i的改变和Western Blot表达与HIBD组类似。免疫组化染色结果显示NR1阳性表达细胞数逐渐增多,注射后1hphospho-NR1 S897表达明显下调,几乎未见阳性染色细胞;△_Ψ_m值呈进行性降低,注射后15min、30min、1h和2h注射侧:注射对侧△_Ψ_m比值分别为(0.84±0.65)、(0.66±0.16)、(0.66±0.21)和(0.61±0.36),与正常对照相比差异均具有统计学意义(P<0.05);NMDA微量注射后左右大脑半球[Ca~(2+)]_i的改变与HIBD类似,注射侧[Ca~(2+)]_i值为(667.52±47.78)nmol/L,明显高于正常对照组且差异具有统计学意义(P<0.05);丘脑区和海马回NR1的Western Blot表达明显增强、Phospho-NR1 S897表达明显减弱。 结论:(1)NR1 S897位点的磷酸化使7日龄新生大鼠脑皮质神经细胞具有正常生理功能;HI损伤使NR1 S897位点的磷酸化表达进行性下调,细胞不能发挥正常功能;(2)NMDA注射可诱导与HI损伤类似的变化,进一步证实了缺氧缺血性脑损伤中“HI—NMDA—phospho-NR1 S897去磷酸化—细胞损伤”损伤途径的重要性;(3)加强对影响phospho-NR1 S897磷酸化过程的调控因子研究可对开发减轻HI脑损伤的新途径提供实验依据。……   
[关键词]:NR1;磷酸化;缺氧缺血;新生鼠;
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中南大学2006年