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肾小管上皮细胞转分化在DN发病中的作用及大黄酸对其影响的研究

宁建平

   背景及目的 肾小管间质病变是糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)进展为终末期肾脏病(ESRD)的重要病理基础,细胞外基质(ECM)在肾间质过量堆积是其基本病理特征。目前认为肾间质ECM主要由肌成纤维细胞(MyoF)分泌。研究发现在病理条件下,肾小管上皮细胞可发生上皮细胞—肌成纤维细胞转分化(Epithelial-myofibroblast transdifferentiation,EMT),即丧失原有的上皮细胞表型特征,而获得MyoF的新特征,是肾间质MyoF的重要来源。有研究报道,在单侧输尿管梗阻(UUO)模型大鼠,EMT参与了肾间质纤维化的发生与发展。但在DN肾小管间质病变进程中,是否也存在上述EMT过程尚不清楚。 转化生长因子-β_1(TGF-β_1)是EMT的重要启动和促进因子。TGF-β_1的生物学作用广泛而复杂,具有正面和负面的多样效应。单纯抑制TGF-β_1这一上游因子,则可能在抑制EMT的同时引起其他不利的负效应。于是,寻找作用更特异、有效的下游因子或环节,成为新近研究的关注热点。整合素连接激酶(Integrin-linked kinase,ILK)是新近发现的一种与整合素细胞内区域结合的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,已有研究证实ILK是整合素、生长因子、MAPK及Wnt等多个信号传导通路的交叉点和重要效应物。以往对ILK的研究主要集中在肾小球,近年在UUO模型大鼠和体外细胞培养的研究结果表明,肾间质ECM的聚积与ILK表达正相关;ILK介导TGF-β_1/Smad信号传导通路,可能参与肾小管EMT过程。然而,在DN肾小管上皮细胞中ILK表达情况及其与EMT关系,目前所知尚少。 人们一直在努力寻找能有效阻抑肾间质纤维化的药物。大黄是临床治疗慢性肾脏病处方使用频率很高的一味中药。大黄酸(Rhein)是从大黄蒽醌衍生物中分离出的一种前体组分,为大黄的主要有效成分。临床与实验研究结果均表明大黄酸能有效减缓慢性肾脏病进程,具有肯定的肾脏保护作用。但大黄酸对DN的小管间质病变及EMT过程的作用、影响,尚少见报道。 本研究拟从糖尿病大鼠模型和体外细胞培养两个实验层面,采用反映上皮细胞表型特征的E钙粘素(E-Cadherin)、反映MyoF表型特征的α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和作为ECM成分的纤维连接蛋白(FN)等指标,观察在DN小管间质病变中,肾小管上皮细胞转分化与ILK表达的改变,以及EMT与ILK的关系;并用大黄酸干预处理,观察大黄酸对上述过程的影响。旨在从EMT这一新途径,探讨DN病变进展新机制,寻找DN防治的新靶点。 方法 (一)动物实验部分 雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(N组,n=12)、糖尿病模型组(D组,n=12)和糖尿病大黄酸干预组(R组,n=12)。采用腹腔内一次注射STZ 55mg·kg~(-1)诱导糖尿病模型。大黄酸组大鼠于糖尿病成模后,给予大黄酸100mg·kg~(-1)·d~(-1)灌胃。分别于第8、16周末,每组随机选取6只大鼠,留24小时尿测定尿蛋白排泄量;处死大鼠,心脏取血测血清肌酐(SCr)、血甘油三酯(TG)和胆固醇(CH);肾脏原位灌洗后,取肾组织:石蜡切片,HE和Masson染色观察肾小管间质损害及纤维化;免疫组化法检测肾小管上皮细胞E-Cadherin、α-SMA、FN与ILK的表达;免疫印迹方法检测肾组织E-Cadherin、α-SMA、FN与ILK蛋白的表达。 (二)细胞实验部分 应用细胞培养技术,按下列实验条件分组培养人近端肾小管上皮细胞(HK-2):空白对照(N组),低糖(5.5mmol/L)DMEM培养基;高糖(D组)葡萄糖浓度30mmol/L;高糖+大黄酸25μg/ml(R-25组);高糖+大黄酸50μg/ml(R-50组);高糖+大黄酸100μg/ml(R-100组)。分别于24h、48h、72h收集各组细胞,免疫印迹方法检测E-Cadherin、α-SMA、FN与ILK的蛋白表达。 结果 1.D组和R组糖尿病大鼠的尿蛋白量、血清肌酐值与肾小管间质损伤指数、间质胶原相对面积等均随病程进展而增加,明显高于同期N组(P<0.01);大黄酸(R组)能减轻上述病变。16周时R组较同期D组,其肾脏保护作用更显著(P<0.05)。 2.D组和R组糖尿病大鼠肾小管上皮细胞E-Cadherin表达随病程逐渐减少(P<0.05),而α-SMA、FN表达逐渐增加,均较同期N组有显著差异(P<0.05,P<0.01);同时,ILK表达也明显上调(P<0.05)。ILK与E-Cadherin呈负相关(r_s=-0.82,P<0.05),与α-SMA、FN呈正相关(r_s=0.83,P<0.05;r_s=0.94,P<0.01;)。大黄酸干预可改善上述变化,16周时R组较同期D组各指标的改善呈现显著差异(P<0.01)。 3.高糖环境下HK-2细胞(D组)与N组比较,E-Cadherin的蛋白表达减少(P<0.05);ILK、α-SMA、FN蛋白的表达增多(P<0.05)。经大黄酸处理后的各R组与D组比较E-Cadherin的蛋白表达上调(P<0.05),α-SMA、FN及ILK、蛋白表达下调(P<0.05),且与大黄酸呈剂量、时间依赖性关系(P<0.05)。 结论 1高糖环境下HK-2细胞与糖尿病大鼠肾小管上皮细胞,E-cadherin表达减少,α-SMA、FN表达增加,表明DN肾小管间质病变进程中,存在肾小管上皮细胞转分化(EMT),成为MyoF的重要来源。 2在DN病理状态下,肾小管上皮细胞呈现ILK高表达,且与EMT过程高度相关;ILK参与介导了DN的EMT过程,在其中起着正向调控作用。 3大黄酸可下调DN肾小管上皮细胞ILK表达,阻抑EMT,减轻DN的肾小管间质病变,这可能是大黄酸治疗DN的重要作用机制之一。大黄酸具有治疗DN的潜能与前景。……   
[关键词]:糖尿病肾病;肾小管上皮细胞;上皮细胞-肌成纤维细胞转分化;整合素连接激酶;大黄酸
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中南大学2007年