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负载HCMV pp65抗原肽的HLA-A*1101-GPI四聚体的制备和鉴定

李丰耀

   目的:构建HLA-A*1101重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的融合蛋白(HLA-A11-BSP)原核表达载体,在大肠杆菌中表达该融合蛋白,并进一步制备负载人巨细胞病毒(HCMV)pp65抗原肽的HLA-A*1101-GPI四聚体。 方法:以RT-PCR法扩增并克隆HLA-A*1101重链基因的cDNA,以PCR方法构建HLA-A11-BSP的表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。优化HLA-A*1101-BSP在大肠杆菌中的诱导表达的温度、时间和诱导剂IPTG浓度,并以抗HLA-A*0201抗血清进行免疫印迹鉴定HLA-A11-BSP的表达水平。将初步纯化的HLA-A*1101-BSP与β_2-微球蛋白(β_2m)和HCMV抗原肽pp65_(16-24)(GPISGHVLK,简称GPI)一起利用稀释法进行重折叠复性,获得可溶性HLA-A*1101-GPI单体,经生物素化和纯化后,与Streptavidin-PE结合形成四聚体,以流式细胞仪分析四聚体的染色特性。 结果:从HLA-A2阴性的供者外周血单个核细胞中克隆到HLA-A*1101重链基因的cDNA,以此cDNA为模板,将编码HLA-A*1101重链胞外域1—276序列与编码BSP的序列融合,构建HLA-A11-BSP融合蛋白表达载体,重组质粒经测序验证完全正确。融合蛋白在BL21(DE3)中诱导后获得高效表达,约占菌体总蛋白的20%;其相对分子质量约为35000,与理论值一致。免疫印迹分析显示表达产物存在于包涵体中,上清液中几乎无任何产物存在。重链分子在轻链β_2m和抗原肽GPI存在下进行体外复性,获得可溶性HLA-A*1101-GPI单体,经生物素化并以阴离子交换柱层析分离,得到生物素化的纯化单体,后者与Streptavidin-PE按4:1比例混合后形成HLA-A*1101-GPI四聚体,多聚化程度达80%。流式细胞仪分析显示HLA-A*1101-GPI四聚体具有与特异性细胞毒T细胞(CTL)的结合活性。 结论:成功构建表达HLA-A11-BSP融合蛋白的原核表达载体,该融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式获得高水平表达,并进一步获得可溶性HLA-A*1101-GPI单体和四聚体,为研究HLA-A*1101限制性CTL的免疫应答打下基础。……   
[关键词]:人类白细胞抗原;生物素化酶底物肽;融合蛋白;原核表达;HLA-A*1101;四聚体;流式细胞术;巨细胞病毒
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:暨南大学2007年