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诺氟沙星单克隆抗体的筛选、制备及初步鉴定

占春霞

   诺氟沙星(Norfloxacin,NFLX)可导致人体产生中毒性表皮坏死溶解等不良反应,不仅对人体造成直接危害,而且动物性食品中残留的NFLX容易诱导人类致病菌产生耐药性,使药物失效,还严重影响国内动物性食品的出口。随着NFLX在食品动物中的广泛使用,其残留问题已引起广泛关注,因此,加强对该药在动物性食品中的残留检测和监督是非常必要的。近些年来发展起来的免疫学检测方法,根据抗原抗体结合的原理,具有灵敏度高、特异性强、快速、经济等优点,而其中的ELISA检测法尤其适合于低含量药物残留的大规模筛选检测,具有极其广泛的应用前景。 要建立酶联免疫检测(ELISA)方法,制得针对NFLX的特异性抗体是必要前提,而NFLX属半抗原,因此,首先必须制备出全抗原免疫小鼠,才能进一步制备出针对NFLX的特异性抗体。本研究首先通过两种不同的化学方法,分别合成了两种NFLX人工抗原——NFLX-BSA免疫原和NFLX-OVA检测用包被原,采用杂交瘤技术制备出抗NFLX的单克隆抗体,这是首次研制抗诺氟沙星单抗,为NFLX残留ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。 首先采用碳二亚胺法,以牛血清白蛋白(BSA)为载体蛋白,与NFLX偶联合成人工免疫原NFLX-BSA;采用氯甲酸异丁酯法(又称混合酸酣法),将NFLX与载体卵清白蛋白(OVA)交联合成检测用人工包被原NFLX-OVA,并且进行紫外扫描、动物免疫试验及偶联比计算等方面的鉴定,结果表明人工抗原制备成功。NFLX-BSA和NFLX-OVA的结合比约为9.7:1和8.2:1。 制备成功的NFLX-BSA免疫原经透析、凝胶过滤层析等方法纯化,与等量的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂经乳化后,按从50-150μg/只鼠(以蛋白量计)逐次增加的剂量,采用腹腔注射与皮下注射相结合的方法,免疫4-6周龄纯种健康雌性BALB/c小鼠。间接ELISA和间接竞争ELISA检测结果表明,小鼠都产生特异性抗体,融合前,效价最高者达到1:12800。 对所有小鼠尾静脉取血检测特异性抗体,对血清效价最高的小鼠取脾脏,分离脾细胞,50%PEG-3350作促融剂,将免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,融合率为68.1%,阳性率为1.0%。通过有限稀释法亚克隆两次后,筛选到一株抗诺氟沙星的单克隆抗体,命名为3E9。 取成年6-8周龄雌性BALB/c小鼠,提前1周腹腔注入0.5ml/只弗氏不完全佐剂,将处于对数生长期的杂交瘤细胞注入经过预处理的小鼠腹腔内,制备腹水,采集腹水后,经辛酸-硫酸铵法粗略纯化,-20℃保存备用。应用间接ELISA法测定抗NFLX单克隆抗体的效价和工作浓度。培养上清的效价为1:16,腹水效价为1:1.6×10~3,单抗最佳工作浓度为1:1.0×10~3。间接竞争ELISA结果表明,单克隆抗体3E9的IC50=2.51μg/ml,检测限为0.122μg/ml,与所检测的其它几种氟喹诺酮类药物,恩诺沙星钠盐、盐酸环丙沙星、盐酸双氟沙星、盐酸沙拉沙星、甲磺酸培氟沙星和甲磺酸达氟沙星都没有交叉反应。……   
[关键词]:诺氟沙星;人工抗原;偶联;单克隆抗体;残留检测
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:暨南大学2007年