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链霉素残留免疫学快速检测技术研究

范国英

   链霉素(streptomycin,SM)是一种常用抗生素类药,是动物源性食品中常见的残留药品之一,尤其在牛奶中的残留日益引起人们的关注。免疫学分析技术以其敏感、特异、简便等优点已被广泛应用于药物残留检测领域。本研究对SM的免疫原性,人工抗原的合成、多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb)制备及其特性、试剂盒研制及其性能、免疫金标试纸的研制及其性能、液-质联用(LC-MS)的确证等进行了研究。主要研究结果如下: 1.链霉素经氧-羧甲基羟胺肟化处理后引入羧基,采用EDC一步法分别合成免疫原BSA-EDC-SM和包被抗原OVA-EDC-SM;用戊二醛法和1,4-丁二醇缩水甘油醚分别合成BSA-GA-SM和BSA-di-SM;采用SDS-PAGE凝胶电泳和紫外扫描测定BSA-EDC-SM、BSA-GA-SM和BSA-di-SM的BSA与SM的分子结合比分别为1∶23、1∶15和1∶10。用三种免疫原免疫Balb/C小鼠,获得了高价、敏感和特异的抗血清。 BSA-EDC-SM免疫组中1#小鼠的多克隆抗体对SM的IC50为45.8μg/mL,对双氢链霉素(DHSM)的交叉反应为90.6%,与其他氨基糖苷类药物或抗生素药物的交叉反应均小于0.001%。BSA-di-SM和BSA-GA-SM免疫组的多克隆抗体对DHSM、其他氨基糖苷类药物或抗生素类药物的交叉反应均小于0.001%。 2.用不同剂量BSA-EDC-SM和不同间隔时间免疫6只新西兰白兔,制备SM多克隆抗体;其中低剂量长间隔组的Ⅱ-1#号兔的抗体灵敏度最好,其标准曲线呈S型,符合4参数Logit曲线拟合,半数抑制浓度(IC50)为5.81μg/L。 用BSA-EDC-SM免疫Balb/c小鼠,应用细胞融合技术,筛选出F139-3A9-C4株杂交瘤细胞,用体内诱生腹水法制备腹水SMmAb。间接ELISA法测定杂交瘤细胞培养液上清和腹水的效价分别为1∶320和1∶512000,腹水抗体亲和力常数Ka为7.5×1010 L/mol。杂交瘤细胞染色体数目为96~102条,平均98.6条,同种型为IgG2a/κ;腹水中SM mAb的标准曲线呈S型,符合4参数Logit曲线拟合,IC50为8.99μg/L,与DHSM的交叉反应为93.6%,与其他氨基糖苷类药物或抗生素类药物均无交叉反应。 3.用SM mAb研制SM残留检测阻断和竞争ELISA试剂盒(ELISA-kit),其中竞争ELISA-kit的质量性能优于阻断ELISA-kit。 竞争ELISA-kit的标准曲线呈S型,IC50为6.22μg/L,线性检测范围为1.0~256.0μg/L,灵敏度为0.52μg/L;奶样和尿样的添加回收率分别为83.2%和86.89%,平均批内和批间变异系数均小于15%;与DHSM的交叉反应为82.71%,与其它氨基糖苷类药物或抗生素类药物的交叉反应均小于0.001%;不同生物基质对该试剂盒的敏感性和检测结果影响不大。 4.依据胶体金免疫层析技术研制SM和DHSM的多残留快速检测免疫金标试纸(SM-Strip),胶体金颗粒最佳粒径为25±1.0nm,金标记SM mAb的最佳标记浓度为13.75μg/mL。SM-Strip的标准曲线呈S型,机读灵敏度为0.42μg/L。目测灵敏度为4.14μg/L。目测结果与DHSM的交叉反应为4.0μg/L,与其他氨基糖苷类药物或抗生素类药物无交叉反应。 5.建立了猪尿液和牛奶中的SM残留检测的LC-MS法,并以该方法确证了竞争ELISA-kit和SM-Strip的敏感性、特异性和稳定性,参比分析法结果表明,SM-Kit和SM-Strip与LC-MS具有较好的相关性,符合率为100%。 ELISA-kit和SM-Strip均具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合于SM残留快速检测的推广应用。……   
[关键词]:链霉素;人工抗原;单克隆抗体;ELISA试剂盒;SM-金标试纸条
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2007年