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表达AIV H7HA和H9HA基因重组鸭瘟病毒载体的构建与DNA疫苗研究

邢明伟

   禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒引起的禽类感染和/或疾病综合征,自1878年首次于意大利报道以来,目前己普遍存在于世界上许多国家和地区,给养禽业造成了巨大的经济损失。高致病性禽流感(HPAI)多以突然发病和高死亡率为主要特征,常常导致感染鸡群的全部死亡,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类烈性传染病。 本研究首先根据GenBank所发表的AIV H7亚型HA基因的cDNA序列,利用Primer5.0软件,设计一对引物,以本实验室所保存的pMD18-T-H7-HA阳性质粒为模板扩增出H7HA基因;通过RT-PCR技术扩增了禽流感分离株CK/MJ/0823/00(H9N2)的H9亚型HA基因,并进行序列测定与分析。结果表明:经AIV H7亚型HA基因测序和序列分析,H7HA基因由起始密码子到终止密码子的核苷酸长为1692bp,编码563个氨基酸残基,与其它17个国内外参考毒株的核苷酸和推导氨基酸同源性比较,核苷酸的同源性为76.3%-84.3%,推导氨基酸同源性为83.3%-93.2%;CK/MJ/0823/00(H9N21分离株H9亚型HA基因测序及序列分析结果为:H9HA基因ORF长为1683bp,编码560个氨基酸残基,与其它17个国内外参考毒株的核苷酸和推导氨基酸同源性比较,核苷酸的同源性为67.1%-95.1%,推导氨基酸的同源性为91.9%-99.7%。 将克隆到pMD18-T载体的H7和H9亚型HA基因亚克隆到载体p-3-3.1的多克隆位点中,构建AIV H7HA和H9HA基因的重组克隆载体p-3-3.1-H7-HA和p-3-3.1-H9-HA。接下来分别将鉴定正确的重组质粒p-3-3.1-H7-HA和p-3-3.1-H9-HA用XhoⅠ单酶切,分别回收携带真核表达元件H7HA和H9HA的基因。转移载体质粒pUC-TK2.9-LacZ经XhoⅠ酶切,去磷酸化后回收。再将携带真核表达元件H7HA和H9HA的基因通过XhoⅠ位点亚克隆到含有鸭瘟病毒复制非必需片段的pUC-TK2.9-LacZ转移载体质粒的XhoⅠ位点上,从而分别成功构建携带真核表达元件含有目的基因H7HA和LacZ报告基因及鸭瘟病毒复制非必需区的DPV转移载体质粒和携带真核表达元件含有目的基因H9HA和LacZ报告基因及鸭瘟病毒复制非必需区的DPV转移载体质粒,分别命名为pUC-TK2.9-LacZ-H7-HA和pUC-TK2.9-LacZ-H9-HA。最后将AIV能诱导宿主产生保护性免疫反应的主要抗原基因H7HA和H9HA作为候选基因,以具有CMV启动子的真核表达载体pcDNA3.1(+)作为载体,构建了含有以上两种基因的DNA疫苗。 将以上构建的两种DNA疫苗转染MDCK细胞进行瞬时表达,结果在转染后48h两种质粒均获得了表达,且表达的蛋白可与抗AIV的抗体发生特异性结合,于荧光显微镜下可见绿色荧光,而质粒pcDNA3.1(+)及未转染质粒的MDCK细胞均未出现荧光,呈阴性反应。体外转染实验表明,两种疫苗质粒均能在体外获得表达,从而为下一步的动物试验提供了必要的前提条件。 为了评价所构建的两种DNA疫苗的免疫效果,分别将其以每只鼠10μg的剂量分两点肌肉注射接种6-8周龄BALB/C小鼠,同时以质粒pcDNA3.1(+)和PBS作对照。2周后加强免疫,隔2周后进行第三次免疫。各组免疫鼠在首次免疫前、后(加强免疫前)、加强免疫后(第三次免疫前)及第三次免疫后2周分别采血,用HI和ELISA的方法检测抗体的动态变化,同时检测外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞的动态变化。结果显示:(1)免疫前各DNA疫苗免疫组检测不到HI抗体,但免疫后各DNA疫苗组的HI抗体效价迅速升高;(2)ELISA检测结果显示,各DNA疫苗免疫组均不同程度的产生了抗体;(3)各DNA疫苗免疫组在免疫后外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞都有不同程度的升高。通过本研究证实,所构建的DNA疫苗能够诱导BALB/C小鼠的体液免疫和细胞免疫应答。 本研究克隆了AIV H7亚型HA基因和CK/MJ/0823/00(H9N2)分离株H9亚型HA基因,利用基因重组技术分别构建了含有H7HA和H9HA基因的重组鸭瘟病毒转移载体;又将AIV H7HA和H9HA基因分别插入含有CMV启动子的真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点中,从而分别成功构建了含有AIV H7HA和H9HA两种保护性抗原基因的DNA疫苗并进行了体外瞬时表达和动物体内接种试验。总之,通过本研究将为水禽流感病毒病的诊断试剂和疫苗研制提供科学的实验依据,奠定良好的技术基础和物质储备。……   
[关键词]:禽流感病毒;H7HA基因;H9HA基因;重组鸭瘟病毒载体;DNA疫苗
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:东北林业大学2007年