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中成药的多指标分析及其在质量控制中的应用

李艳荣

   中成药是指以中医药理论为指导,以中药材为原料,按规定的处方和工艺加工成一定剂型的、供临床使用的药物。目前,中成药的质量控制多模仿化学合成药物的质量控制模式,即以已知的某一单一活性成分或指标成分为控制质量的指标,用以定性和定量分析,借以判断药品是否“合格”。而这种模式半个多世纪一直作为中成药质量的主要模式,其变化只是分析手段和测定指标的更迭。当然中药的作用并不是多种活性成分的简单相加,尤其是中成药(大多为复方制剂)更是如此,中成药的疗效是多种成分协同作用的结果,因此模仿化学药质量控制的模式解决中药质量控制的问题越来越显露出它的不足。复方中药各味药的剂量和比例会影响其药效是一个不争的事实,而多指标的质量控制方法不仅能反映制剂的工艺水平,且能在一定程度上反映所用药材的质量,同时指标成分的分离测定还可以反映传统中药的配伍状况,更符合中医理论。因此对中成药进行多指标的质量控制能更好地表征其质量。但由于中成药本身的特殊性,如化学成分复杂、溶解性差别较大、指标成分含量较低,给其多组分的提取以及同时分离测定带来了一定的困难。 本文采用HPLC法对中成药多指标成分提取方法、检测方法、体外溶出和体内药代动力学的研究,建立了适合中成药多指标成分的检查体系,并利用该体系考察了多个厂家三黄片、清胃黄连、功劳去火片的多指标成分含量、功劳去火片多指标成分的体外溶出和药代动力学的情况。研究结果表明:(1)采用灵敏度高,专属性强、特异性好的HPLC法测定中成药中的多种指标成分既能够达到中药含量检测的要求,又能使被测成分和其他组分分离,不干扰其测定。(2)不同厂家的同一中药制剂(三黄片)的主要指标成分含量差别较大,反映在疗效也必然会有所差别,因此用多指标成分来表征三黄片的质量更科学、更合理。(3)多指标成分评价功劳去火片溶出度方法的建立,全面地评价了其体外溶出情况,为评价和控制功劳去火片的质量提供了依据。(4)大鼠体内药代动力学的研究表明复方配伍组方对方中指标成分的药代参数有一定影响,且黄芩苷和盐酸小檗碱的药动学特征彼此差异较大。功劳去火片体内外相关性评价的试验结果表明其相关性良好(P<0.01)。 一、中成药多指标成分提取方法和提取溶剂的研究 (一)不同提取方法对三黄片中5种蒽醌类成分提取量的影响 目的:研究以乙醇、十二烷基硫酸钠(SDS)为提取溶剂对5种蒽醌类成分提取率的影响。 方法:研究了分别以乙醇回流法、乙醇超声法、不同浓度SDS超声提取法提取三黄片中5种蒽醌类成分的提取方法,并利用HPLC法测定了其提取量。 结果:采用0.5%SDS水溶液作为提取溶剂可以明显提高三黄片中5种蒽醌类成分的提取量。 结论:0.5%SDS水溶液SDS可以提高三黄片中蒽醌的提取量。 (二)清胃黄连片4种指标成分提取方法与提取溶剂的研究 目的:研究清胃黄连片中盐酸小檗碱、黄芩苷、栀子苷和甘草酸4种指标成分的最佳提取方法,为评价和控制复方中药的质量提供依据。 方法:通过考察清胃黄连片中4种指标成分在不同提取方法和不同提取溶剂下的提取情况,来优化提取体系,选择适合清胃黄连片的提取方法。 结果:采用甲醇为提取溶剂,超声30 min能有效的提高清胃黄连片中4种指标成分的提取量。 结论:该提取体系适用于清胃黄连片多指标成分的提取。 二、中成药多指标成分检测方法的研究 (一)不同厂家三黄片4种指标成分的含量测定目的:建立HPLC法同时测定三黄片中大黄素、大黄酚、黄芩苷、盐酸小檗碱含量的方法,并比较了不同厂家三黄片4种指标分的含量。 方法:采用Kromasil C18色谱柱(250×4.6 mm, 5.0μm);流动相组成为A:甲醇-乙腈(50:50),B:甲醇-乙腈-0.5%三乙胺水溶液(磷酸调pH3.0)梯度洗脱;检测波长254 nm;流速1.0 mL·min~(-1)。 结果:大黄素、大黄酚、黄芩苷和盐酸小檗碱含量测定方法的线性关系良好,回归系数分别为0.999 8~0.999 9;回收率分别为98.2%~100.3%,RSD为0.7%~1.4%,方法的重现性良好,RSD均小于1.4%。 结论:该方法专属性强,结果准确可靠,重现性好,可用于三黄片中大黄素、大黄酚、黄芩苷和盐酸小檗碱的含量测定,有利于更好地控制三黄片的质量。不同厂家生产的三黄片大黄素、大黄酚、黄芩苷和盐酸小檗碱4种指标成分含量相差较大,可能与不同厂家的生产工艺有关。多指标成分表征三黄片质量更全面、更科学。 (二)同时测定清胃黄连片中4种指标成分的含量目的:建立反相高效液相色谱法测定清胃黄连片中栀子 苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草酸4种指标成分含量的方法。方法:采用HypersilC18色谱柱(250×4.6 mm, 5.0μm);流动相乙腈-0.5%三乙胺(磷酸调pH值3.0)梯度洗脱,检测波长为230 nm;流速1.0 mL·min~(-1)。 结果:栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草酸的线性范围分别为:4.82~77.2μg·mL~(-1)、5.80~92.8μg·mL~(-1)、1.63~26.1μg·mL~(-1)和6.40~102μg·mL~(-1)(r≥0.999 7),平均回收率均大于98.0 %。 结论:该方法专属性强,结果准确可靠,重现性好,可用于清胃黄连片中栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草酸的含量测定,能更好的控制清胃黄连片的质量。 (三)功劳去火片中栀子苷、黄芩苷及盐酸小檗碱的同时测定 目的:建立反相高效液相色谱法同时测定功劳去火片中栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱含量的方法。 方法:采用Kromasil C18色谱柱(250×4.6 mm, 5.0μm);流动相组成为A:乙腈,B:乙腈-0.5%三乙胺水溶液(磷酸调pH3.1)(10:90)梯度洗脱;流速1.0 mL·min~(-1),检测波长254 nm。 结果:栀子苷、黄芩苷和盐酸小檗碱的线性范围分别为:3.22~206μg·mL~(-1)(r=0.999 8),2.95~186μg·mL~(-1)(r=0.999 9)和1.64~104μg·mL~(-1)(r=0.999 9)。平均回收率均大于98.4%。 结论:该方法专属性强,结果准确可靠,重现性好,可用于功劳去火片多指标成分的含量测定,以便更好地控制功劳去火片的质量。 三、功劳去火片体大鼠体内外相关性的研究 (一)功劳去火片中3种指标成分的溶出度检查 目的:建立了以盐酸小檗碱、黄芩苷和栀子苷为指标成分,测定功劳去火片溶出度的方法,为评价和控制其质量提供依据。 方法:照《中国药典》2005版(二部)溶出度测定法中的桨法,以500 mL 0.5%十二烷基硫酸钠水溶液为溶出介质,转速100 r·min~(-1)。取样后,采用高效液相色谱法测定,色谱柱:Kromasil C18色谱柱(250×4.6 mm, 5.0μm),流动相:A为乙腈;流动相B为乙腈:0.5%三乙胺水溶液(磷酸调pH 3.1)(10:90),梯度洗脱,检测波长254 nm,流速1.0 mL·min~(-1)。 结果:三批样品3 h时盐酸小檗碱、黄芩苷和栀子苷的溶出百分数均超过了75%。 结论:该方法准确、可靠,可作为功劳去火片溶出度的测定方法,以控制中药复方质量。 (二)功劳去火片在大鼠体内的药代动力学 目的:建立反相高效液相色谱法同时测定功劳去火片黄芩苷、盐酸小檗碱在大鼠血浆中的浓度及其药代动力学行为,为临床合理用药提供依据。 方法:大鼠经灌胃给药后,血浆样品经甲醇沉淀蛋白进行色谱分离,采用HPLC法测定其血浆中黄芩苷和盐酸小檗碱的浓度。采用Kromasil C18(250×4.6 mm,5.0μm)色谱柱;流动相为乙腈:0.5%三乙胺水溶液(磷酸调pH3.1)(30:70);流速:1.0 mL·min~(-1);柱温:室温;检测波长:265 nm;进样量:20μL。 结果:黄芩苷和盐酸小檗碱的线性范围分别为:0.061~3.91μg·mL~(-1)(r=0.999 7)和0.017~1.06μg·mL~(-1)(r=0.999 9),最低定量限分别为0.061μg·mL~(-1)和0.017μg·mL~(-1)。平均回收率均大于97.2%,精密度与准确度均符合生物样品分析要求。灌胃给药后,黄芩苷在大鼠体内的代谢符合二室模型,其主要的药代动力学参数为: K_(21)=(0.740±0.30) 1/h , K_(10)= (0.143±0.035) 1/h,K_(12) =(1.26±0.8) 1/h,t_(1/2β)=(13.5±1.0) h, t_(1/2α)=(0.399±0.18) h , T_(max) = (0.352±0.086) h , C_(max) = (0.940±0.18)μg·mL~(-1)。盐酸小檗碱符合一室模型,其主要的药代动力学参数为: t_(1/2(Ke)) = (3.65±0.69)h , t_(1/2(Ka)) = (0.073±0.019) h,t1/2(Km)= (0.076±0.022) h,T_(max) = (0.605±0.12) h,C_(max) = (0.254±059)μg·mL~(-1)。 结论:功劳去火片大鼠体内药代动力学的研究表明复方配伍组方对方中指标成分的药代参数有一定影响,且黄芩苷和盐酸小檗碱的药动学特征彼此差异较大。功劳去火片体内外相关性评价的试验结果表明其相关性良好(P<0.01)。……