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中药复方配伍的化学变化与复方中药的质量表征

郝福

   中医药学是中华民族优秀传统文化的重要组成部分,是国之瑰宝,民生所依。复方是中医用药的主要形式,而复方的特色与核心是药物间的配伍,配伍使整个方剂达到整体综合调节的作用。中药复方配伍的化学成分不是单味药化学成分数及量上的简单相加,复方的效应也不是机械的毒、副作用的抵消,复方配伍使有效成分的质或量发生了变化,复方的药效是多种组分共同作用的结果。 目前,已有多项内容或模式应用于中药复方配伍的研究,如中药复方物质基础的研究、中药复方药理学的研究、中药复方配伍规律的研究、中药复方药代动力学研究等内容或模式。其中,研究相对较多的主要集中在药理和临床疗效上,而对其化学物质基础、配伍机理、多指标的质量评价等内容研究相对薄弱。当前复方中药的质量标准往往仅对单一指标成分的含量进行限定,这很难全面地表征其质量。多指标成分的分离测定对于复方中药的质量控制具有重要意义,各指标成分含量及其比例不仅可以反映制剂工艺水平,而且可以表征和保证复方中药(及其制剂)的药效。 本课题通过研究配伍前后龙胆泻肝汤、桂枝汤中指标成分在体内外的动态变化特点,从某些方面揭示了中药复方配伍理论的科学内涵;通过分别建立龙胆泻肝丸与桂枝颗粒多组分同时分析方法,阐明了复方中药多指标质量表征的必要性和可行性。研究结果表明:(1)关木通在龙胆泻肝汤中配伍以后可以降低有毒成分马兜铃酸A的煎出量(n=6,P<0.05),当归与关木通的配伍抑制了马兜铃酸A的煎出量;(2)在桂枝汤中,桂枝、白芍配伍前后桂皮酸、芍药苷的煎出量未见明显改变(n=6,P>0.05);但复方配伍后总多糖煎出量增加;炙甘草配伍以后甘草酸的煎出量也明显降低(n=6,P<0.01),煎液pH值的改变可能是含量降低的原因;(3)桂枝汤在大鼠体内的药代动力学表明,桂枝煎液与桂枝汤中桂皮酸在大鼠体内的代谢过程基本一致,而炙甘草煎液与桂枝汤中甘草酸在大鼠体内的代谢过程有所差异,表现为桂枝汤中甘草酸的药代参数Cmax、AUC均显著增大(n=6,P<0.01),T1/2Ke、Tmax均显著降低(n=6,P<0.01)。(4)建立了能够同时测定龙胆泻肝丸3个组分的RP-HPLC分析方法,该法具有专属性强、灵敏度高、快速、准确等优点,可以用于该制剂的质量评价与质量控制。(5)建立了能够同时测定桂枝颗粒3个组分的RP-HPLC分析方法,该方法可以较全面地表征桂枝颗粒的质量。 一、中药复方配伍的化学变化研究 (一)配伍对龙胆泻肝汤中马兜铃酸A煎出量的影响 ①关木通配伍前后马兜铃酸A煎出量的变化 目的:比较关木通配伍前后马兜铃酸A含量的差异,研究传统龙胆泻肝汤配伍的科学依据。 方法:采用HPLC测定关木通单煎液与龙胆泻肝汤中马兜铃酸A的含量。 结果:马兜铃酸A在0.76~51.0μg·mL-1范围内线性良好,关木通单煎液和复方煎液的方法回收率分别为98.6%和96.5%;单煎液中马兜铃酸A的含量明显高于复方煎液(n=6, P<0.05)。 结论:关木通在龙胆泻肝汤中配伍以后可以降低马兜铃酸A的煎出量。 ②拆方研究配伍前后马兜铃酸A煎出量的变化目的:研究复方配伍以后龙胆泻肝汤中马兜铃酸A煎出量变化的原因。 方法:以中医药理论为指导,采用撤药分析法对龙胆泻肝汤进行拆方,建立HPLC测定了各拆方组中马兜铃酸A的煎出量,同时对数据进行了ANOVA分析。 结果:当归和(或)生地与关木通配伍可以影响马兜铃酸A的煎出量。 结论:按照中医理论,复方配伍能够降低关木通中马兜铃酸A的煎出量,可以降低肾毒性。 ③关木通与当归、生地配伍后的马兜铃酸A含量的变化目的:探究关木通与当归、生地配伍后的马兜铃酸A含量变化的原因。 方法:采用HPLC法测定各拆方组中马兜铃酸A的煎出量,同时测定各组药渣中马兜铃酸A的含量,以计算回收率。结果:各煎液药渣中马兜铃酸A的回收率均不低于96.7%,关木通与当归配伍可以使马兜铃酸A的煎出量降低41.3%(n=5, P<0.01)。 结论:关木通与当归配伍共煎,煎煮过程马兜铃酸A未发生化学反应生成新物质或分解,当归的加入可抑制马兜铃酸A的煎出量。 (二)配伍对桂枝汤中桂皮酸、芍药苷、甘草酸及总多糖煎出量的影响 ①配伍对桂枝汤中的桂皮酸、芍药苷和甘草酸煎出量的影响 目的:比较配伍前后桂枝汤中桂皮酸、芍药苷和甘草酸煎出量的变化。 方法:建立HPLC测定各单味药煎液与桂枝汤中指标成分的含量。 结果:桂皮酸、芍药苷、甘草酸的浓度与峰面积均呈良好的线性关系,各指标成分的平均回收率均在98.0%~101.0%之间;桂枝在桂枝汤中配伍前后桂皮酸含量未见明显改变(n=6,P>0.05),白芍在桂枝汤中配伍以后芍药苷含量未见明显改变(n=6,P>0.05),而炙甘草配伍后甘草酸含量降低了近50%(n=6,P<0.01)。 结论:中药复方配伍由于体系微环境的改变或发生物理化学变化,某些指标成分煎出量有可能发生改变。 ②拆方研究配伍对桂枝汤中甘草酸含量的影响目的:研究复方配伍以后桂枝汤中甘草酸煎出量变化的原因。 方法:采用正交设计法对桂枝汤进行拆方,建立HPLC测定了各组甘草酸的煎出量,同时测定各煎液pH。 结果:甘草酸在8.75~280μg·mL-1内线性关系良好,甘草酸的平均回收率为99.4%;因素B(白芍用药/不用药)对桂枝汤中甘草酸的煎出量的影响有统计学意义(n=8,P<0.01),各煎液pH有所差异。 结论:白芍的加入降低了甘草酸的煎出量,煎液pH的降低可能是煎出量改变的直接原因。 ③桂枝汤分煎液与合煎液中总多糖含量的比较研究目的:比较桂枝汤分煎液和合煎液中总多糖含量的差异,探讨复方配伍的合理性。 方法:采用苯酚-硫酸法来测定多糖含量,对两组煎液的总多糖含量进行方差分析。 结果:葡萄糖在20~120μg·mL-1范围内线性关系良好,平均换算因子为1.884,桂枝汤单煎合液与共煎液中多糖平均含量分别为16.3 mg·mL-1、22.1 mg·mL-1。 结论:桂枝汤复方共煎可以增加总多糖的溶出量。 (三)配伍对桂枝汤中桂皮酸与甘草酸的药代动力学影响目的:比较大鼠灌胃桂枝煎液、甘草煎液、桂枝汤煎液 后桂皮酸与甘草酸的药代动力学参数的差异。 方法:大鼠在灌胃桂枝煎液、甘草煎液及桂枝汤后,利用HPLC法测定血浆中桂皮酸与甘草酸的浓度,利用3P87药代动力学软件估算相应的药代动力学参数。 结果:桂皮酸与甘草酸在大鼠体内的药代学过程均符合二室模型。桂枝煎液与桂枝汤中桂皮酸在大鼠体内的代谢过程基本一致,而炙甘草煎液与桂枝汤中甘草酸在大鼠体内的代谢过程有所差异,表现为桂枝汤中甘草酸的药代参数Cmax、AUC均显著增大(n=5,P<0.01),T1/2Ke、Tmax均显著降低(n=5,P<0.01)。 结论:桂枝汤复方配伍甘草酸的吸收程度增大,复方配伍具有合理性。 二、复方中药的质量表征 (一)HPLC测定龙胆泻肝丸中龙胆苦苷、黄芩苷、栀子苷 目的:建立HPLC同时测定龙胆泻肝丸中龙胆苦苷、黄芩苷、栀子苷三个指标成分的含量。 方法:采用Hypersil C18色谱柱(250×4.6 mm, 5.0μm);流动相由乙腈-1%冰醋酸溶液组成;检测波长254 nm;流速1.0 mL·min-1。结果:栀子苷、龙胆苦苷、黄芩苷的线性范围分别为4.60~147μg·mL-1、9.05~290μg·mL-1和8.40~268μg·mL-1(r均大于0.999 9),平均回收率均大于98.1%。 结论:该方法专属性强,结果准确可靠,重现性好,可以同时测定龙胆泻肝丸中龙胆苦苷、黄芩苷、栀子苷三个指标成分的含量,可以较全面地表征该丸的质量。 (二)HPLC测定桂枝颗粒中桂皮酸、芍药苷、甘草酸目的:建立HPLC同时测定桂枝颗粒中桂皮酸、芍药苷、甘草酸三个指标成分的含量。 方法:采用Phenomenex C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),流动相由乙腈-1%冰醋酸溶液(调pH为3.7)进行梯度洗脱,流速1.0 mL·min-1;检测波长250 nm;柱温为室温;进样量20μL。 结果:芍药苷、桂皮酸、甘草酸分别在1.898~121.5μg·mL-1、1.969~126μg·mL-1、2.5~160μg·mL-1内线性关系良好,相关系数均大于0.999 8;芍药苷、桂皮酸、甘草酸的平均回收率分别为99.7%、99.3%、98.8%,RSD值均小于2.0%。 结论:本文建立了简便、快速,可用于桂枝颗粒3个指标成分同时检测的HPLC法,该法为桂枝颗粒的质量控制提供了新的检测手段。……