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腺病毒介导的人eNOS基因转染抑制血管平滑肌细胞增殖及其机制的研究

兰勇

   第一部分人eNOS基因重组腺病毒载体的构建与鉴定 目的:利用AdMax腺病毒载体系统构建人内皮型一氧化氮合成酶基因(heNOS)和.-半乳糖苷酶基因(LacZ)重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒 方法:利用聚合酶链反应(PCR)扩增出heNOS全长基因,插入PSUCMV中构建成腺病毒穿梭质粒PSUCMV-heNOS,转化大肠杆菌感受态DH5.,挑取阳性菌株,酶切鉴定正确后,DNA测序,结果与基因数据库中人内皮型一氧化氮合成酶cDNA序列一致;与5型腺病毒骨架质粒PBHGE3共转染293细胞包装病毒颗粒,得到含有携带heNOS的复制缺陷型重组腺病毒载体(AdCMV-heNOS)的病毒上清,纯化病毒,用TCID50方法测病毒滴度。 结果:成功构建人eNOS重组腺病毒载体和LacZ重组腺病毒载体,病毒滴度达3.5X10~(10)PFU/ml和3.0X10~(10)PFU/ml,通过PCR鉴定正确。 结论:heNOS重组腺病毒的构建为血管内膜增生等疾病的基因治疗提供可能。 第二部分腺病毒介导的人eNOS基因转染抑制血管平滑肌细胞增殖及其机制的研究 目的:观察腺病毒介导的人eNOS基因转染对体外培养的人血管平滑肌细胞增殖的作用,探讨人eNOS基因转染对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKI)p21、p27表达的变化及细胞周期、凋亡的影响。 方法:原代培养人脐带动脉平滑肌细胞并纯化鉴定,以不同的感染复数(MOI)的heNOS重组腺病毒转染血管平滑肌细胞,噻唑蓝比色法测定吸光度值(OD570),绘制细胞生长曲线。同时LacZ重组腺病毒转染和未转染的血管平滑肌细胞为对照组。NADPH染色、细胞免疫组化、RT-PCR、western blot检测血管平滑滑肌细胞中的人eNOS基因的表达。放射免疫法检测血管平滑肌细胞中的cGMP的表达变化;western blot检测血管平滑肌细胞中p21、p27蛋白的变化,流式细胞术分析对细胞周期分布及凋亡的影响。 结果:随着MOI值的增大,吸光度值逐渐降低,转染120h以后MIO为300组与MOI为100、150、200组及空白对照组比较显著抑制血管平滑肌细胞的增殖(p<0.01)。以MOI为300转染血管平滑肌细胞48h,NADPH染色、细胞免疫组化、RT-PCR、western blot均证实有人eNOS基因的表达,对照组无表达。放射免疫法检测heNOS转染组cGMP含量明显高于LacZ组和未转染组,有显著差异(p<0.01)。western blot证实heNOS转染组的p21、p27蛋白表达明显上调(p<0.05)。细胞流式检测heNOS转染组G0/G1期细胞平均百分数与对照组比较明增加(p<0.05)。转染24h和72h后三组无明显细胞凋亡(p>0.05)。 结论:人eNOS基因转染血管平滑肌细胞抑制细胞增殖,通过p21、p27上调导致细胞周期的阻滞,无诱导细胞凋亡。 第三部分腺病毒介导的人eNOS基因转染抑制大鼠颈动脉损伤后新内膜形成 目的:探讨腺病毒介导的人eNOS基因局部转染对大鼠颈动脉损伤后新生内膜的影响。 方法:SD大鼠球囊损伤颈动脉后,分别局部转染滴度为3.0×10~(10)pfu/mlLacZ重组腺病毒(n=8)和3.5×10~(10)pfu/ml heNOS重组腺病毒(n=8)100ul,转染30分钟,同时设单纯损伤为对照组。于4、7、14、21天后切取损伤动脉,免疫组化法、western blot检测转染损伤动脉壁中层heNOS的表达。苏木精-伊红染色观察损伤动脉的内膜和中膜的增生情况,单盲法计算机分析内膜和中膜的面积及其比值,判断内膜增生程度。 结果:成功建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,免疫组化、western blot证实heNOS基因在转染损伤的动脉壁中层有效的表达。颈动脉损伤7天后内膜开始增生,14天后进一步加重,血管平滑肌细胞迁移和增殖,基质细胞增多,21天后内膜增生严重,管腔狭窄明显而heNOS转染内膜增生不明显。形态学分析显示损伤14、21天后heNOS组内膜面积、内膜面积/中膜面积(I/M)明显低于损伤组和LacZ转染组(p<0.05)。而LacZ组和损伤组之间差别不明显(p>0.05)。 结论:腺病毒介导的人eNOS基因局部转染大鼠球囊损伤的颈动脉抑制新内膜的形成,可减少球囊血管成型术后管腔再狭窄。……