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膜结晶法结晶蛋白质的研究

张新妙

   随着重组DNA技术的发展和表达体系的完善,已知的蛋白质数目有了很大增长。X射线衍射是确定蛋白质结构的最有效方法,而X射线结晶学的应用要求大分子晶体具有足够大的尺寸(大于0.1mm)和完美的质量,以获得精确的衍射数据。然而,许多生物大分子晶体常常难以成长,一般小分子结晶的方法都不适合于大分子的晶体生长。因此,获得质量完美的蛋白质晶体成为蛋白质结构测定的主要瓶颈,需要探索新的结晶方法以制备蛋白质等生物大分子晶体。用膜结晶技术结晶蛋白质可得到适合于衍射分析的大分子蛋白质晶体。 本文首先用渗透膜结晶法进行了几种蛋白质(溶菌酶、木瓜蛋白酶、卵清蛋白、牛血清白蛋白以及脂肪酶)的膜结晶,研究了操作条件对蛋白质渗透膜结晶过程的影响,优化了几种蛋白质的结晶条件,评价了不同结晶条件下的溶剂跨膜通量,探讨了沉淀剂和添加剂对蛋白质渗透膜结晶的作用机理,并对最后得到的蛋白质晶体进行了初步分析。研究结果表明: 对于溶菌酶的渗透膜结晶过程,氯化钠和硫氰酸钠为溶菌酶渗透膜结晶的有效沉淀剂。结晶溶液中加入一定添加剂如丙三醇、PEG4000或PEG6000等,可以有效提高溶剂跨膜通量,改善晶体质量,促进晶体成核及生长,得到质量更完美的晶体。 对于溶菌酶的动态渗透膜结晶,溶菌酶浓度对溶菌酶的动态渗透膜结晶过程有重要影响。过高的溶菌酶浓度使得结品溶液中出现大量粒状沉淀,晶体质量和产率下降,溶剂跨膜通量较低:然而溶菌酶浓度太低,结晶时间较长。一般来说,溶剂跨膜通量随着蛋白质浓度的升高而降低。在研究的溶菌酶浓度范围内,20~30mg╱mL,尤其是20mg╱mL的溶菌酶浓度,更适合于溶菌酶的动态渗透膜结晶,在此浓度下,能有效控制结晶溶液中晶核的数量,得到的晶体尺寸较大,并且结晶时间不至太长。 沉淀剂氯化钠浓度对溶菌酶的动态渗透膜结晶过程也有重要影响。将沉淀剂浓度从4%提高到6.5%(wt/vol),结晶诱导时间缩短;进一步升高沉淀剂浓度到9%,则又使得结晶诱导时间延长,溶剂跨膜通量降低。当沉淀剂浓度大于9%时,结晶溶液中出现大量沉淀。对于溶菌酶的动态渗透膜结晶,4~6.5%的沉淀剂浓度是最佳的沉淀剂浓度范围。对于20mg/mL的溶菌酶,在4%的氯化钠浓度下,洗脱液氯化镁浓度和流速分别为25%和4319μm/s,结晶溶液的最佳流速为288μm/s。 对于洗脱液浓度和流速对溶菌酶动态渗透膜结晶的影响,当氯化镁溶液流速在2880~4319μm/s范围内时,制备了质量完美的溶菌酶晶体。对于洗脱液浓度,溶剂跨膜通量随洗脱液浓度的升高而增长。然而,过高的洗脱液浓度影响最终得到的晶体质量,在较高的洗脱液浓度下,晶体数量增多,但晶体尺寸减小。对于20mg/mL的溶菌酶,在4%的氯化钠浓度下,洗脱夜流速为4319μm/s,进料液流速为288μm/s时,沈脱液浓度控制在20~25%范围内更适合于溶菌酶的动态渗透膜结晶。 对于溶液pH值和离子强度对溶菌酶动态渗透膜结晶的影响,在相同pH值下,离子强度越高,溶剂跨膜通量越大。晶体的晶形主要受溶液pH值的影响,离子强度则主要影响溶剂跨膜通量。在不同pH值下得到了不同晶形的晶体,提高结晶溶液的pH值,晶体从四角晶系向正交晶系过渡。研究发现,以pH4.7的醋酸钠为缓冲溶液时制备了四角晶系和正交晶系的晶体,而以pH6.5和pH8.3的磷酸盐以及pH8.3的Tris-HCl为缓冲溶液时仅得到正交晶系的晶体。正交晶系的生长速度高于四角晶系。晶体从四角晶系向正交晶系的过渡与温度以及蛋白质浓度有关。另外,晶形也是pH值和沉淀剂浓度的函数。 对于结晶诱导时间,在4%和6.5%的沉淀剂浓度下,尤其是4%氯化钠,结晶溶液中的溶菌酶浓度随着时间的推移而增大;而在9%的氯化钠下,结晶溶液中的溶菌酶浓度随着时间的推移而减小。氯化钠浓度对溶菌酶动态渗透膜结晶的影响可归因于对溶菌酶溶解度和溶剂活度双重作用的结果。其他条件相同时,在研究的氯化钠浓度范围内(4~9%),6.5%氯化钠浓度下的结晶诱导时间最短,4%氯化钠下的结晶诱导时间最长。 对于木瓜蛋白酶的静态渗透膜结晶,硫酸铵和磷酸钠均可作为结晶过程的优良沉淀剂。在17℃时,以pH4.7的醋酸盐缓冲溶液为溶剂,在这两种沉淀剂的适当浓度范围内(Na_3PO_4:4~7%;(NH_4)_2SO_4:4~10%),均制备了质量完美的木瓜蛋白酶晶体。通过监控结晶溶液中木瓜蛋白酶浓度随时间的变化,发现磷酸钠为沉淀剂进行木瓜蛋白酶的静态渗透膜结晶,在较低木瓜酶浓度下更容易获得质量完美的木瓜蛋白酶晶体。添加剂PEG600和PEG4000的加入,使得木瓜蛋白酶更容易从溶液中结晶出来,诱导时间缩短,形成质量更好的木瓜酶晶体。晶体尺寸分布表明,实验制备的蛋白质晶体满足衍射分析的需要。 此外,还研究了几种蛋白质(卵清蛋白、牛血清白蛋白、脂肪酶)的静态渗透膜结晶。对于卵清蛋白的渗透膜结晶,在30mg/mL卵清蛋白浓度下,以pH7.3的磷酸盐缓冲溶液为溶剂,3~7%的PEG6000为沉淀剂,20%MgCl_2为洗脱液,实验制备了形状较好,尺寸较大的卵清蛋白晶体;对于牛血清白蛋白的渗透膜结晶,在16~25℃范围内,以pH6.3的磷酸盐为缓冲溶液时,氯化钠、PEG600和PEG6000可作为牛血清白蛋白渗透膜结晶的有效沉淀剂。结晶溶液中加入添加剂聚乙二醇类或DMSO可以有效提高溶剂跨膜通量,增大晶体尺寸;对于脂肪酶的渗透膜结晶,以pH6.3的磷酸盐缓冲溶液为溶剂,硫氰酸钠、丙三醇、PEG400或PEG600为沉淀剂时,实验制备了脂肪酶晶体,其中以丙三醇为沉淀剂制备的晶体质量最好。 最后,又研究了溶菌酶的真空膜结晶,以pH4.7的醋酸盐缓冲溶液为溶剂,溶菌酶浓度为20mg╱mL,4%NaCl为沉淀剂,在0.015MPa的真空度下,结晶液流速为288μm/s时制备的溶菌酶晶体质量较好,在更高流速下制备的晶体尺寸较小,在一定程度上发生聚集并破碎。……   
[关键词]:结晶;蛋白质;微孔疏水膜;跨膜通量;结晶条件;沉添加剂
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:北京化工大学2007年