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肉仔鸡氧化应激模型的研究

武书庚

   本文首先研究了激素处理(注射或口服)对肉仔鸡生产性能、消化能力、免疫功能和肉质的影响,建立了急性和慢性动物营养应激模型;研究了DEX对肌卫星细胞的影响,建立了细胞氧化应激模型;进一步研究了激素对卫星细胞内钙离子浓度的影响。研究表明,三种激素处理的应激模型均能引起肉仔鸡肉质、激素、细胞活性等的变化,产生氧化应激,激素可通过细胞内钙离子途径的转导引起肌肉细胞的代谢变化,从而影响肉质。本研究可为研究应激对肉仔鸡的影响及其机理提供方法学借鉴。现摘要如下: 1、急性氧化应激动物试验模型的研究 选择21d体重相近的健康肉仔鸡公雏210只,随机分成7组,每组3个重复,每重复10只。处理分别为C(对照组)、S(生理盐水注射1 mL/只)、S+R(S+Ru486)、D(6 mg/kg BW)、D+R(D+Ru486)、A(6IU/kg BW)、A+R(A+Ru486),Ru486剂量为50 mg/kg BW;40d时重复上述过程。结果表明: (1)注射ACTH、DEX和PSS均显著影响了肉品品质(pH值降低、滴水损失和肉品剪切强度增加),同时注射Ru486后肉品质的不正常状况得到了缓解,但均未恢复到未注射状态:腿肌的pH值、滴水损失、剪切强度均显著高于胸肌(P<0.01);29d屠宰的肉品pH值、滴水损失均显著高于40d屠宰(P<0.01);40d屠宰鸡肌肉的剪切强度显著高于29d(P<0.01);随着处理后屠宰时间的延长,肌肉pH值降低、滴水损失和剪切强度增加趋势明显。这些结果表明,40d肉仔鸡,DXM(6mg/kg BW)或ACTH(6IU/kg BW)注射处理后8h,可用于模拟研究氧化应激对肉质的影响。 (2)注射DEX、ACTH和PSS后组织(胸肌、腿肌、肝脏和心肌)匀浆中蛋白含量、MDA显著或极显著增加,GSH-Px和SOD显著或极显著降低;同时注射Ru486后这种组织的不正常氧化还原状态得到缓解,GSH-Px和SOD显著高于、蛋白含量和MDA显著低于仅注射DEX、ACTH和生理盐水组,但仍未恢复到对照组水平。注射处理后4h、8h、12h和24h屠宰鸡氧化还原状态的测定结果表明,不同组织对同一指标的反应有别,以8h~12h为合适的激素处理后的作用时间。肌肉注射DEX和ACTH可用于模拟动物的急性组织氧化应激状态。 (3)注射DEX和ACTH后,与其它所有处理组相比,血液TAOC、GSH-Px和SOD均降到了最低,显著低于对照组(P<0.01),二者差异不显著(P>0.05);CAT、MDA、CK和AST则升到了最高,显著高于对照组(P<0.01),两种处理差异不显著(P>0.05)。同时相应注射Ru486后,血液TAOC、GSH-Px和SOD升高,血液CAT、MDA、CK和AST降低,与相应的不注射组均差异显著(P<0.01),但仍高(TAOC、MDA、CK和AST)或低于(GSH-Px、SOD、CAT)对照组(P<0.01)。处理后,随激素作用时间(4h、8h、12h和24h)的延长,TAOC逐渐降低,8-12h无差异;GSH-Px先降低再升高,8~12h最低,无差异;SOD逐渐降低,4~8h无差异:CAT、MDA、CK先升高再降低,8h最高;AST在12~24h达到最高。与29d相比,40d的TAOC、GSH-Px、SOD、CAT和CK均有下降趋势,MDA和AST升高;但只有CAT显著降低,MDA显著升高(P<0.05),其余指标均差异不显著(P>0.05)。注射ACTH和DEX可引起动物血液有关生化指标的激烈变化,引起氧化应激。这些结果表明,40d肉仔鸡,DEX(6mg/kgBW)或ACTH(6IU/kgBW)注射处理后8h后,可用于开展有关氧化应激的试验研究。 2、慢性氧化应激动物试验模型的研究 选择320只21dAA肉仔鸡随机分为4个处理组,每组设8个重复,每个重复10只试鸡。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组分别饮用加有0、10、20和30 mg/L的可的松水,自由饮水和采食,试验期10d。结果表明: (1)可的松饮水对肉鸡FC、ADG、F/G均无显著影响(P>0.05):血液生化分析表明,可的松饮水对血液HDL、LDL、CHOL、TG、肌酐含量无显著影响(P>0.05),但20和30mg/L可的松饮水10d肉鸡血浆TP含量(P<0.05)和尿酸含量(P<0.01)显著升高,30mg/L可的松饮水1d血浆AST活性显著升高(P<0.05)。20和30mg/L可的松饮水组,显著降低了3~4d日粮CP、EE表观代谢率,显著降低了1~2、3~4d的Ash的表观代谢率(P<0.05)。结果表明,20和30mg/L可的松饮水,在饮水的第3~4d即影响到了日粮CP、EE和灰分的消化率,10d时血液TP、尿酸含量升高。 (2)可的松饮水极显著地(P<0.01)增加了胸肌、腿肌6d和10d的滴水损失;显著升高了胸肌pH1(P<0.05),对腿肌无显著影响;pH24胸肌除3d第Ⅱ组显著增加外(P<0.05),其他均无明显变化(P>0.05),但腿肌有增加的趋势(P>0.05);可的松饮水对胸肌、腿肌的相对重量无显著影响(P>0.05);对胸肌含水量亦无显著影响(P>0.05),胸肌蛋白有降低的趋势,显著降低了2、6d胸肌脂肪含量(P<0.05),可的松饮水显著降低了腿肌6d第Ⅲ组水分含量(P<0.05),极显著降低了6d第Ⅱ、Ⅲ组蛋白的含量(P<0.01),显著降低了2d第Ⅲ组和6dⅡ、Ⅲ组脂肪含量(P<0.05)。这表明可的松饮水对肌肉发育的影响不显著,但显著影响肌肉的营养组成。 (3)处理3d,第Ⅳ组鸡皮质酮含量显著高于对照组(P<0.05);血糖浓度在处理1-2d明显升高,处理2d显著(P<0.05)高于对照组:T_3先降低后升高,1~2d均极显著高于(P<0.01)对照组,第3d T_4极显著(P<0.01)高于对照组;对应激氧化状态的影响为,MDA在1~3d和6d时均显著(P<0.05)高于对照纽,SOD第1~3d活性降低,GSH-Px活性处理后1~3d均显著(P<0.05)低于对照组,TAOC第2d显著降低(P<0.05),CK在第6d时显著升高(P<0.05)。这表明30mg/L可的松饮水3d成功地在肉鸡体内诱发了氧化应激。 (4)整个试验期,可的松饮水对心脏、肝脏、胸腺、法氏囊的相对重量均无明显影响(P>0.05);对脾脏相对重量的影响,除第2d显著差异外(P<0.05),对其他时间均无显著影响(P>0.05);可的松饮水对腹脂和肝脏含水量均无显著影响(P>0.05),肝脏脂肪含量在试验处理10d左右极显著增加(P<0.01);可的松饮水显著增加了试验处理2~3d心脏MDA含量,降低了第10d MDA含量(P<0.05),极显著增加了(P<0.01)处理第1d后GSH-Px含量,降低了处理1d后SOD含量(P<0.05);可的松饮水显著增加了试验处理2~3d肝脏MDA含量,处理10d时处理剂量最小的第Ⅱ组MDA含量显著高于对照组,对GSH-PX、SOD的含量的影响明显,除处理第6d时显著高于对照组外,在整个试验期内均显著低于对照组。这表明可的松饮水对组织器官发育的影响较小,而1~3d对心、肝脏的过氧化状态影响显著。 3、肌肉细胞氧化应激模型的研究 用显微镜(观察细胞形态、活细胞个数、台盼蓝染色)、MTY试验、NBT还原试验、脂质过氧化等试验,研究了不同浓度DEX对细胞活性的的影响,并用维生素C(VC)对此模型进行了验证,结果表明: (1)显微镜下可明显看出,活性SCs随DEX浓度的增加而减少明显,DEX浓度大于0.625g/L,几乎未见活的SCs存住;DEX浓度小于0.15625g/L则对SCs的影响较小,腿肌SCs的抗DEX的能力较大。 (2)随着DEX浓度的增加,培养基中的活细胞个数显著减少,台盼蓝蓝染率显著增加,且两项指标均与DEX浓度呈一定的函数关系(活细胞数(Y,×10~4)=35.186e~(-0.7821X);细胞蓝染率(死亡率,Y,%)=44.039X~(-0.3492),X为DEX浓度(g/L)。细胞培养液中添加DEX显著影响了胸肌和腿肌SCs的相对存活率,随DEX浓度增加,细胞存活性呈幂函数曲线降低(胸肌:y=14.944X~(-0.6082):DEX+VC:y=19.642X~(-0.4663);腿肌:y=17.091X~(-0.5193);DEX+VC:y=40.418X~(0.2536);其中X为DEX剂量(g/L)、Y为SCs相对成活率(%))。 (3)DEX处理增加了肌肉细胞的膜脂质过氧化作用,使膜系统受到不同程度的过氧化损伤:肌细胞MDA相对生成量(Y)与DEX(x,g/L)之间呈幂函数关系:胸肌SCs Y=1.5723x~(0.0983);腿肌SCs Y=1.3213x~(0.0789)。随DEX浓度的增加(x,g/L),校正后的NBT被还原量(Y,吸光度值)显著增加,说明氧自由基量增加明显,自由基随DEX浓度升高而升高,二者呈幂函数关系(胸肌和腿肌分别为:Y=0.8328x~(0.457)和Y=0.3898x~(0.3334))。 (4)培养基中添加维生素C改善了肌肉细胞的存活率,随DEX浓度增加,维生素C的改善作用降低;与胸肌相比,腿肌SCs抵御DEX破坏作用的能力更加明显,维生素C对腿肌SCs的改善作用优于胸肌SCs;培养基中添加不同浓度维生素C对细胞相对存活率的影响不同,浓度越大对细胞存活率的改善作用越强,维生素C浓度与细胞相对存活率呈明显的幂函数关系(VC:Y=1.5451x~(0.1007);VC+DEX:Y=1.3099x~(0.0685))。这表明通过向肌SCs培养基中添加不同浓度的DEX可以建立肌肉SCs的氧化应激模型,并用于研究应激对肉质的影响机理、抗应激添加剂的作用机理及选择等。 4、DEX对鸡胸、腿肌卫星细胞中Ca~(2+)影响 用LEICA TCS SP2 SE激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM简称共焦显微镜)和钙离子指示剂Fluo-3/AM标记技术测定了单个细胞内钙离子浓度在不同浓度DEX处理后细胞内的动态变化,以便确定DEX能否激发钙离子信号转导系统,结果表明:用不同浓度DEX处理胸肌和腿肌SCs,细胞内游离钙离子浓度均有相应的变化,随着DEX浓度的降低,两种来源的SCs内钙离子浓度的最大值逐渐降低,达到最大值需要的时间不断延长,细胞内钙离子浓度恢复到静止状态需要的时间延长;胸肌SCs对DEX处理的反应更为敏感;10~(-4)~10~(-6)mol/LDEX均能引起肌细胞内钙离子浓度增加;细胞外DEX可以通过作用于肌肉细胞内钙离子信号转导系统,而影响肌肉细胞代谢。……   
[关键词]:肉仔鸡;肌卫星细胞;氧化应激模型;DEX;ACTH;Ru486;可的松;Ca~(2+)
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2007年