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极细链格孢菌HOG1、PBS2基因克隆及功能初步分析

冯飞

   链格孢菌既是一类重要植物病原真菌,又是具有应用前景的生物资源。从分子水平研究该类菌的功能基因的调控机制,对进一步开发利用该菌具有重要意义。HOG途径参与诱导胁迫反应基因的表达、细胞形态恢复、信息素反应途径的阻遏及致病性等过程。Hog1p和Pbs2p蛋白激酶在细胞壁结构完整性、孢子分化、菌丝形成和浸入生长以及高渗透压甘油形成过程中起到重要作用。本研究通过运用基于λ噬菌体特异位点重组反应Gateway~(?)系统构建极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)cDNA表达文库。通过遗传学手段,我们筛选获得了极细链格孢菌(A.tenuissima)AtHOG1及AtPBS2基因,并且研究了AtHOG1及AtPBS2基因的功能。建立了以抗性基因作为选择标记的技术体系,利用DNA同源重组技术,成功构建了用于敲除极细链格孢菌(A.tenuissima)AtHOG1及AtPBS2基因的质粒,为进一步研究AtHOG1及AtPBS2基因的功能奠定了坚实的基础,主要研究结果如下: 1、链格孢属(Alternaria Nees)真菌是一类庞大的,难以进行形态鉴定的常见真菌。为了进一步确定本试验所用菌种的分类地位,本文成功克隆了rDNA基因。通过序列比对,构建了7个相似菌株的系统发育树,发现该菌株与极细链格孢菌(A.tenuissima)相应的rDNA高度同源,因此将链格孢菌JH505菌株定名为极细链格孢菌(A.tenuissima)。 2、构建了含有attL1及attL2重组位点的重组表达质粒(pRS-DEST42),使用Gateway~(?) LR重组技术与入门文库发生特异重组交换而构建表达文库。经检测,表达文库的平均滴度为2.44x10~6(cfu/ml),文库总容量为2.44x10~7。阳性克性率为100%,平均插入片段大约为1381 bp左右。通过对阳性克隆测序结果的分析,cDNA序列完整。 3、从7.62x10~5个极细链格孢菌(A.tenuissima)cDNA表达文库酵母转化子中筛选获得了12个能使酵母hog1基因缺失突变株在YEPD+1MNaCl中生长且含有极细链格孢菌(A.tenuissima)cDNA表达文库质粒的转化子。这些基因编码的蛋白质序列均与酵母HOG1(ScHOG1)基因编码的355个氨基酸同源,命名为AtHOG1,其编码的蛋白质命名为AtHog1p,该基因编码的蛋白与稻瘟菌MG01822.4蛋白、黑粉菌UM02357.1蛋白、禾谷镰刀菌FG09612.1蛋白及酿酒酵母ScHog1p蛋白的相似性分别为96%、92%、90%和88%。序列比对结果显示,酵母ScHog1p蛋白的催化结构域与其同源蛋白具高度保守,而且三个催化位点及赖氨酸残基均位于ATP结合域内,说明Hog1p蛋白在丝状真菌中是高度保守的。 4、从1.56×10~5个转化子中最终分离而获得了1个能使酵母pbs2缺失突变株在高盐环境下生长的表达文库质粒。该基因全长2,492 bp,编码683个氨基酸。与酵母ScPbs2p蛋白具有42.6%的同源性,命名为AtPBS2,其编码的氨基酸为AtPbs2p。AtPbs2p与烟曲霉XP_752961、稻瘟菌XP_366048及禾谷镰刀菌XP_388867同源序列分别具有55.3%、50.2%和48.6%的相似性。ScPbs2p的催化结构域在丝状真菌也是高度保守的。 5、通过对极细链格孢菌(A.tenuissima)cDNA表达文库的筛选,获得能使酿酒酵母HOG1及PBS2基因缺失突变株具有对抗盐胁迫反应的质粒,通过对AtHOG1及AtPBS2基因在酵母突变菌株中的再次功能验证,发现AtHOG1及AtPBS2基因分别发挥了HOG通路途径的HOG1及PBS2基因的功能,即在盐胁迫条件下体现出与ScHog1p及ScPbs2p蛋白相同的功能,使酵母缺失突变株在高盐环境中生长。 6、基于极细链格孢菌(A.tenuissima)在含有G418(100μg/ml)和潮霉素(Hygromycin B)(100μg/ml)的PDA培养基上不能生长的药物敏感性实验结果,建立了用G418抗性基因及潮霉素(Hygromycin B)抗性基因作为选择标记的技术体系,从而为研究极细链格孢菌(A.tenuissima)功能基因的敲除、缺失突变株鉴定提供了可靠的筛选标记,并为后续研究打下必要的基础。 7、利用同源重组技术,分别选择以AtHOG1及AtPBS2基因上下游同源序列约500 bp作为同源臂,上游同源序列3’端连接G418抗性基因,以保证缺失突变株的检测及鉴定。成功构建了用于敲除极细链格孢菌(A.tenuissima)AtHOG1及AtPBS2基因的质粒,为在极细链格孢菌(A.tenuissima)中敲除AtHOG1及AtPBS2基因奠定了坚实的基础,为进一步研究链格孢菌(A.tenuissima)AtHOG1及AtPBS2基因的功能及作用机理提供了重要的试验材料和工具。……   
[关键词]:极细链格孢菌;cDNA表达文库;AtHOG1及AtPBS2基因;蛋白激酶;蛋白激酶激酶
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2007年