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BF2/肽四聚体的构建及其在传染性支气管炎病毒特异性T细胞反应评价中的应用

刘光亮

   MHCⅠ类分子/肽四聚体技术是1996年建立的一种检测特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicT lymphocytes,CTLs)的方法,该方法已在人类及模式动物的相关领域得到较为广泛的研究和应用,然而在兽医学相关研究中只有近年来往猪和马上有了初步的研究,目前该项技术在禽类的研究尚属空白。 为了构建鸡的MHC/肽四聚体,本实验从SPF莱航鸡全血克隆了鸡MHCⅠ重链α(BF2)和β2微球蛋白(Chβ2m)全基因,经系统进化分析表明本实验所获得的BF2基因为B15单倍型。然后利用软件分析了其各自的信号肽序列及BF2的跨膜区,利用引物分别缺失了这两段基因的信号肽序列以及BF2的跨膜区,并在BF2基因的3’端融合了BirA底物肽(BSP)序列。将经改造的两段基因分别克隆至融合蛋白重组表达载体中,分别命名为pET-BF_2-BSP和pET-Chβ2m,并将其分别转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3)中进行诱导表达,获得了包涵体表达的重组蛋白,表达产物溶解于8M脲中,经SDS-PAGE分析,结果表明所得融合目的蛋白分别约为38kD和15kD,Western-blot结果显示该重组蛋白均成功融合了6×His标签。为了获得大量的目的蛋白,优化了诱导剂浓度、起始诱导菌体浓度及诱导时间等表达条件。此外,建立了重组蛋白BF2-BSP和Chβ2m在变性状态下通过镍柱亲和层析纯化包涵体的方法,获得了高纯度的重组蛋白BF2-BSP和Chβ2m。 根据文献所报道,合成了鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白N_(71-78)T细胞表位肽,将其与纯化后的重组蛋白BF2-BSP和Chβ2m在重折叠缓冲液中复性。复性后在快速蛋白液相色谱仪(FPLC)上分离出复性组装成功的BF2/肽单体复合物。将该单体复合物在体外进行生物素化,其产物再次采用FPLC通过分子筛分离出生物素化后的BF2/肽单体复合物;通过链霉亲和素迁移实验检测体外生物素化效率,然后将生物素化后的BF2/肽单体复合物与藻红蛋白(PE)标记的链霉亲和素按一定比例反应生成BF2/肽四聚体。 为了检测所制备BF2/肽四聚体的功能,采用10~(5.5)EID_(50)的IBV H52株接种一周龄SPF鸡,10d后采抗凝血用淋巴细胞分离液分离PBMC,调整细胞浓度后取1×10~6个细胞进行抗鸡CD8单抗和BF2/肽四聚体双色荧光染色,采用流式细胞术检测并分析染色结果,结果表明所制备的BF2/肽四聚体可用于检测IBV N蛋白特异性T淋巴细胞,检测一周龄SPF鸡接种H52后10d时针对N蛋白的特异性T细胞比率为3.65%。 为了探讨SPF鸡在感染IBV后体内抗体水平及针对N蛋白特异性的T淋巴细胞的动态变化,将125羽SPF鸡随机分为三组分别作为接种免疫组、攻毒对照组和空白对照组。采用IBV H52标准毒株对其通过滴鼻方式进行免疫,之后每3天剖杀5羽观察各脏器的病理学变化、检测血清抗体效价并采用BF2/肽四聚体评价其N蛋白特异性T细胞的比例;免疫15d时采用IBV M41对免疫组和攻毒对照组进行攻毒,同样检测上述指标。最后综合评价IBV在免疫及攻毒后血清抗体和 N蛋白特异性T细胞的动态变化趋势及两者之间的相互关系。检测结果表明H52滴鼻免疫后特异性T细胞免疫的产生早于血清抗体IgG的出现,攻毒结果显示在SPF鸡未产生坚强的体液免疫时仍能抵抗同型强毒的攻击,提示特异性T细胞在抵抗IBV早期感染免疫反应过程中可能起着重要作用。……   
[关键词]:鸡MHC1类分子;BF2-BSP;鸡β2m微球蛋白;BF2/肽四聚体;传染性支气管炎病毒;核蛋白
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2007年