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鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立及基因功能研究

祁小乐

   鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)引起的一种主要危害3-6周龄雏鸡的急性、高度接触性传染病。该病于1957年首发于美国Gumboro地区,50年米,一直威胁着养禽业的发展。免疫抑制、抗原变异,特别是超强毒株(vvIBDV)的出现,使得该病的防控形势更加严峻。国际兽疫局(the Office Internationnal des Epizooties,OIE)将IBD列为“影响社会经济的重要疾病”。关于IBDV的变异以及毒力和细胞嗜性的分子基础,一直是科研工作者研究的重点之一。 本课题组的前期研究将超强毒Gx株(vvIBDV)经SPF鸡胚传5代、CEF上传20代驯化致弱为减毒株Gt。Gx株致鸡死亡率高达60%以上且不适应CEF细胞培养,Gt株对鸡无明显毒力且能在CEF上增殖,传代致弱过程中的F9代毒对鸡的毒力显著降低而且适应CEF细胞培养。 本研究建立了IBDV基因组长距离高保真PCR方法(LA-PCR),利用此方法克隆了IBDV减毒株Gt的全基因组以及超强毒Gx传代致弱过程中的F9代毒的VP2并对其进行了测序。序列分析发现,与Gx株比较,F9代毒VP2有2个氨基酸突变(Q253H和A284T),Gt株VP2在此基础上又有10个氨基酸突变。另外,Gx株与Gt株在VP3和VP4上各有4个、6个氨基酸差异。本研究的目的是构建高效IBDV反向遗传操作系统,研究VP2、VP3、VP4等基因的序列差异与IBDV细胞嗜性、复制和毒力的关系。 目前用于IBDV研究的体外转录、基于T7RNA聚合酶的体内转录、RNA聚合酶Ⅱ体内转录等反向遗传操作系统在病毒拯救效率和操作简便性等方面仍然存在着一些问题。本研究以全新的思路成功构建了RNA polymeraseⅡ介导的IBDV高效反向遗传操作系统。分别在Gt株基因组两端引入了锤头状核酶结构(Hammerhead ribozyme,HamRz)和丁肝病毒核酶结构(Hepatitis delta ribozyme,HdvRz),并将其克隆在真核表达载体pCAGGS的CMV增强子和β肌动蛋白启动子下游,构建IBDV感染性克隆pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT,经Plasmid Midi Kit(QlAGEN)纯化后,在Lipofectamine~(TM) 2000(Invitrogen)的介导下,直接转染DFI细胞,72h后取上清继续在CEF上传代。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的IBDV,且存在分子标签。拯救毒在CEF上能产生特有的砂砾状CPE,且与亲本毒Gt有一致的复制动力学曲线。该系统高效、简便、稳定,具有良好的细胞普适性,能在DFI、Vero/E6、Vero/P12等多种细胞上高效拯救出病毒。IBDV高效反向遗传操作系统的建立为深入研究IBDV的基因功能奠定了基础,也为其它双RNA病毒的反向遗传操作提供借鉴。 采用融合PCR(fusion PCR)的方法对Gx、F9、Gt等三个毒株的VP2基因进行了相互替换,利用所建立的反向遗传操作系统,拯救出了三个VP2基因嵌合病毒rGx-F9VP2、rGx-GtVP2、rGt-F9VP2。通过复制动力学试验和SPF鸡攻毒试验,证明:VP2的253和284位氨基酸决定IBDV细胞嗜性,Q253H和A284T可使vvIBDV适应CEF培养,并且具有明显的减毒作用;VP2的A222P、I242V、I256V、D279N、I294L、S299N、S330R等七个氨基酸变化可促进IBDV在CEF上的复制,这七个位点也与IBDV的毒力相关。 另外,将vvIBDV Gx株的VP3/3’NCR、VP4/VP3/3’NCR、VP4替换Gt株的相应区域,利用上述反向遗传操作系统,拯救出三个嵌合病毒rGt-GxVP3/3’NCR、rGt-GxVP4/VP3/3’NCR、 rGt-GxVP4。通过病毒复制动力学试验和对SPF鸡攻毒试验,证明VP3与IBDV在CEF上的复制相关(其中P981L可能有正向促进作用);VP3不影响IBDV的毒力;VP4不影响IBDV的毒力以及在CEF上的复制,对VP3亦无协同作用。 本研究用全新的思路成功构建了RNA polymeraseⅡ介导的IBDV反向遗传操作系统,并对IBDV VP2、VP3、VP4的功能作了研究,对全面了解IBDV的结构与功能,明确IBDV变异的分子基础,揭示IBDV致病与免疫的分子机制,探索IBDV分子致弱方法,研发适合于流行毒株的新型疫苗具有重要意义。……   
[关键词]:鸡传染性法氏囊病病毒;Gt株;反向遗传操作;VP2;VP3;基因功能
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2007年