手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊和子孢子差异表达基因的研究

韩红玉

   鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于肠道所引起的一种危害严重的全球性寄生虫病,给养鸡业造成巨大的经济损失。目前控制球虫病的主要方法包括化学药物防治和疫苗免疫预防,但由于这些方法存在安全、价格以及抗药虫株出现等问题,迫切需要寻找新的防治手段来控制球虫病。而研制高效安全的抗球虫病基因工程疫苗和新药物的关键在于寻找到重要的虫体抗原基因。本论文以对鸡危害最为严重的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)为研究对象,开展了E.tenella孢子生殖发育阶段差异表达基因的分离、鉴定等研究,为探讨鸡球虫的入侵和生长发育机制,研制高效、安全的抗球虫疫苗和新药物奠定了重要基础。 1.利用抑制性消减杂交技术和cDNA微阵列技术筛选E.tenella孢子化卵囊和子孢子阶段虫体差异表达基因 为了分离鉴定E.tenella孢子发育阶段虫体的差异表达基因,分别以E.tenella未孢子化卵囊和孢子化卵囊为驱动组,子孢子为实验组;未孢子化卵囊为驱动组,孢子化卵囊为实验组,利用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建了1个E.tenella子孢子与孢子化卵囊的消减cDNA文库(ZB),1个子孢子与未孢子化卵囊的消减cDNA文库(ZW)和1个孢子化卵囊与未孢子化卵囊的消减cDNA文库(BW)。经PCR鉴定,2个子孢子消减cDNA文库的重组率都为96%,孢子化卵囊消减cDNA文库的重组率为98%,大部分插入片段都大于500 bp。从构建好的3个消减cDNA文库中共挑取3004个克隆制成cDNA微阵列。芯片杂交分析后获得1371个差异表达基因克隆,其中从BW消减cDNA文库中获得245个,从ZB消减cDNA文库中获得582个,从ZW消减cDNA文库中获得544个。对其中727个差异表达基因克隆进行测序,结果获得了657条有效ESTs序列(BW文库197条有效ESTs,ZB文库275条,ZW文库185条),代表118个单一基因,其中孢子化卵囊31个,子孢子87个。序列同源性搜索结果显示:31个孢子化卵囊单一基因中,蛋白功能已知的有12个,蛋白功能未知的有19个,在球虫中已报道的有7个;87个子孢子单一基因中,蛋白功能已知的有23个,蛋白功能未知的有64个,在球虫中已报道的有6个。从中选择了5个差异表达基因克隆,应用实时定量PCR进行验证,结果显示与芯片杂交结果一致。BLASTX同源性比较分析后发现:孢子化卵囊阶段虫体差异表达基因编码的蛋白与E.tenella微线蛋白、TA4抗原蛋白、表面抗原蛋白,刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)的热激蛋白和蛋白质二硫异构酶,人隐孢子虫(Cryptosporidium.hominis)卵囊壁蛋白等有较高的同源性;子孢子阶段虫体高表达基因编码的蛋白与恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶、钙依赖性蛋白激酶,约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)神经磷脂酶C,E.tenella SERPIN1蛋白、微线蛋白、反转录酶等有较高的同源性。提示这些基因编码的蛋白可能参与了卵囊孢子化的形成、虫体的入侵、虫体在宿主细胞内的生长发育、虫体与宿主细胞的相互作用、细胞代谢、免疫调节及细胞信号传导等。本研究为分析鉴定鸡球虫孢子发育阶段虫体差异表达基因,探讨与鸡球虫入侵和生长发育相关基因的作用机制等奠定了基础。 2.E. tenella孢子化卵囊和子孢子差异表达新基因全长cDNA的克隆与分析 根据差异表达基因的ESTs序列,利用RACE技术扩增获得8个E. tenella新基因的全长cDNA,其中包括5个孢子化卵囊新基因全长cDNAs(编号为:BW1-A05、BW1-E06、BW3-F04、BW3-D10、BW11-H07;Genbank登录号:EF552212、EF552214、EF552213、EF552211、EF552218),3个子孢子新基因全长cDNAs(编号为:ZB1-A02、ZB1-A08、ZB11-A04;Genbank登录号:EF552216、EF552217、EF552215)。利用生物信息学分析软件对新基因编码蛋白的理化性质、跨膜结构、抗原位点等进行了分析预测,对编码蛋白的保守功能域、结构位点及同源性蛋白进行了搜索,结果显示4个基因编码的蛋白与其它顶复器原虫蛋白有较高的同源性,其中孢子化卵囊高表达基因BW11-H07编码的蛋白与T. gondii的假想蛋白有较高的同源性;BW1-E06基因编码的蛋白与推测的T.gondii蛋白质二硫键异构酶(putative PDI-like protein)有较高的同源性;子孢子阶段高表达基因ZB11-A04编码的蛋白与T.gondii天冬氨酸蛋白酶3(toxomepsin 3)有较高同源性;ZB1-A02基因编码的蛋白与婴儿利氏曼原虫(Leishmania infantum)蛋白激酶有较高的同源性;其余基因编码的蛋白可能是E. tenella特有的蛋白。本研究为鸡球虫候选基因工程疫苗靶分子和新治疗药物靶标的筛选提供了重要的参考依据。 3.E. tenella新基因在大肠杆菌中的表达 将获得的E. tenella差异表达新基因(BW1-E06、BW3-F04、ZB1-A02、ZB1-A08)全长cDNA连接到原核表达载体pGEX-4T-2中,成功构建了4个重组表达质粒pGEX-4T-E06(4T-E06)、pGEX-4T-F04(4T-F04)、pGEX-4T-A02(4T-A02)、pGEX-4T-A08(4T-A08),并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导表达,纯化获得4个重组融合蛋白(GST-E06、GST-F04、GST-A02、GST-A08),其中4T-E06表达的融合蛋白大部分以可溶性蛋白形式出现,其余3个重组质粒表达的融合蛋白都以包涵体形式存在,利用GST resin成功纯化了4个重组融合蛋白。Western-blot分析结果表明4个重组蛋白都具良好的抗原性。进一步深入研究这些基因以及编码蛋白的功能,对研制鸡球虫候选疫苗和新治疗药物都具有重要意义。 4.E. tenella重组蛋白免疫保护效果的初步研究 为评价本研究研制的几种基因重组抗原在鸡体中诱导的免疫保护效果,将重组表达抗原GST-E06、GST-A02、空载体pGEX-4T-2表达蛋白GST分别设高(100μg)、中(50μg)、低(25μg)三个免疫剂量加弗氏佐剂肌肉免疫鸡。同时将4T-E06、4T-A02、4T-A08、4T-F04重组表达质粒转化的活菌和空载体质粒转化的活菌分两个剂量(150μg和300μg)口服免疫鸡。分别于7、17和27日龄三次免疫鸡,31日龄时经口攻击感染E. tenella 2×10~4个卵囊/只。结果显示:1)增重:所有免疫组鸡增重量均低于不免疫不攻虫组,重组蛋白免疫组增重最多的是4T-A02(50μg)免疫组,其相对增重率为80.7%;口服活菌免疫组,增重较多是重组表达菌4T-A08(300μg)和4T-A02(150μg)剂量免疫组,相对增重率为83.3%和81.7%,与不免疫攻虫组(73.2%)相比差异显著(p<0.05)。2)卵囊产量:重组蛋白免疫组卵囊产量最低的为4T-E06(50μg)免疫组,相对卵囊产量为63.6%;口服活菌免疫组的卵囊产量最低的为4T-A02(300μg)免疫组,相对卵囊产量为66.6%;3)肠道病变记分:重组蛋白免疫组病变记分与不免疫攻虫组差异不明显,但50μg免疫剂量组的病变记分都低于不免疫攻虫组,其中最低的免疫组为4T-A02(50μg);口服免疫组病变记分都低于不免疫攻虫组的病变记分,其中最低的免疫组为4T-A02(300μg),与不免疫攻虫组差异显著(p<0.05)。深入对这些重组抗原的递呈、免疫佐剂以及不同免疫组合等方面进行研究,同时进一步对其它孢子发育阶段差异表达基因及其基因产物诱导对鸡抗球虫病的效果进行评估,将有助于早日获得可在现场推广应用的球虫基因工程疫苗。……   
[关键词]:柔嫩艾美耳球虫;抑制性消减杂交;cDNA微阵列;差异表达基因;克隆;表达;免疫
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2007年