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枯草芽孢杆菌B-332菌株发酵条件及其抗菌物质分离纯化的研究

刘雪

   稻瘟病是全世界稻区危害最严重的水稻病害之一,每年对世界水稻产量的影响高达30%,现有防治稻瘟病的手段多以抗性植株和化学农药为主,化学农药会造成环境的污染及生态平衡的破坏,生物农药具有安全、无毒副作用、不污染环境等优点,大力发展生物农药已成为必然的趋势。因此,对水稻稻瘟病的植病生防领域研究具有重要的现实意义。本研究以枯草芽孢杆菌B-332菌株为实验材料,通过摸索该菌株摇瓶发酵工艺的技术和数据,确定该菌株发酵的最佳培养基和发酵条件,为该菌株的发酵生产奠定基础;此外,分离纯化和获得各分离的组分,测定它们质谱图及抗菌活性,对解析分离各组分对稻瘟病菌抑制的作用机理,揭示该菌株该菌株对稻瘟病菌防治的深层原因具有十分重要的意义。 1.将芽孢数量作为评价发酵工艺的主要标准,抗菌粗提物含量作为辅助标准。采用结晶紫染色法和平板倾注法相结合的方法测量发酵液中的芽孢数量,用紫外分光光度计法测量发酵液中抗菌粗提物的含量。明确了发酵液中抗菌粗提物的浓度与其在272.9nm波长下的吸收值之间的线性关系,标准方程为y=0.06x+0.153,R~2为0.9994,拟和效果较好。 2.对枯草芽孢杆菌B-332菌株摇瓶发酵工艺进行了优化,确定正交优化后的培养基主要成分为:豆饼粉6.0%、蔗糖2.5%、硫酸铵0.7%、柠檬酸三钠0.3%等;培养条件方面,确定种龄为18h、接种量为10%,对装量、温度和转速等条件优化后确定装量80mL/500mL、温度30℃、转速180r/min。基本明确了该综合条件下发酵过程的参数变化规律,发酵周期终点为72h,此时芽孢数为1.43×10~(11)cfu/mL,比出始条件的4.03×10~9cfu/mL提高了34.48倍,抗菌粗提物含量达剑213.82mg/mL。 3.等电点法提取该抗菌粗提物,即对该菌株发酵液离心后,将其pH值调至4.0,抗菌粗提物可以完全沉淀出来,抗菌粗提物经过高效液相色谱-质联用仪的分离纯化,得到5个组分,按照出峰时间顺序,它们的荷质比(m/z)分别为1045.0、1057.8、1072.3、1017.5和1031.1,预测4个组分的结构(荷质比(m/z)为1017.5的除外),依次为Bacillomycin D(iso-C15)、BacillomycinD(50%-iso-C16)或Bacillomycin D(50%-n-C16)、Bacillomycin D(ante-iso-C17)及Bacillomycin D(n-C14),它们结构间的区别在于相差1个或几个-CH_2-基团;各组分均对稻瘟病菌有抑制作用,荷质比(m/z)为1045.0、1057.8、1072.3组分的抑制效果最强,并且这3种组分对稻瘟病菌成熟菌丝体的致畸作用与B-332菌株的致畸作用相同,都是使稻瘟病菌菌丝体膨大、溶涨、破裂,这个结果更加证实了该菌株荷质比(m/z)为1045.0、1057.8、1072.3组分是B-332菌株产生对稻瘟病菌有抑制作用的主要原因。……   
[关键词]:枯草芽孢杆菌;分离纯化;芽孢;发酵;稻瘟病菌
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国农业科学院2007年