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嗜水气单胞菌溶血素A片段基因的克隆、表达及其产物的免疫学特性

赵秀敏

   嗜水气单胞菌是目前引起淡水鱼类暴发性流行病的主要病原,是一种条件性病原菌。近年来有关该菌感染的报道日益增多,引起了水产学界、兽医学界和医学界的广泛重视,被公认为是一种人-畜-鱼共患的致病微生物。一般认为本菌的致病与相关的毒力因子密切相关,特别是溶血素,研究证明溶血素本身就具有溶血性、肠毒性和细胞毒性作用,并对鳗鲡、鲫鱼、小白鼠等受试动物具有独立的致病作用,是重要的保护性抗原。T-Chakraborty等建议,将编码Aer毒素的基因(结构基因)称为AerA,而将具有调控表达和活性的AerA的上位和下位基因区域分别称为AerC和AerB。本研究通过从分子生物学水平对嗜水气单胞菌的结构基因(hlyA)进行分析,并在原核生物大肠杆菌中进行融合表达,成功构建了嗜水气单胞菌溶血素基因A片段的克隆载体pGEMtTHA和重组表达载体pETTHA。体外表达产物经8次免疫小白鼠后,制备了溶血素抗血清。Western-blot试剂盒检测纯化蛋白结果表明:重组溶血素作为抗原免疫能使小鼠产生特异性的抗体,为溶血素C片段的研究奠定了良好的基础。重组溶血素的大量纯化和抗体的大量制备有利于嗜水气单胞菌溶血素的深入研究。 1嗜水气单胞菌溶血素A片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 以嗜水气单胞菌TPS30的基因组DNA为模板,以Genbank中已报道的嗜水气单胞菌AHTPS30HEM(accession NO. AB021152)的基因序列设计引物,应用PCR技术扩增出国内分离株AhTPS30的溶血素1482bp的结构基因片段序列,将其克隆到pGEM-T easy载体上,成功构建了嗜水气单胞菌溶血素基因A片段的克隆载体pGEMtTHA,经过比对其序列结果显示:与Genbank中报道的基因序列同源性达到了98%。将此基因片段克隆入pET32a(+)载体上,成功构建成重组表达质粒pETTHA,并在大肠杆菌BL21(DE3)中,经终浓度0.1mM的IPTG诱导培养重组表达菌,30℃诱导前培养2h,诱导培养3h,经菌体裂解外源基因表达产物的SDS-PAGE分析。结果显示:重组表达菌的裂解产物与对照菌相比出现了一条新的表达带,大小与经DNA TOOLS分析的外源核苷酸融合蛋白的理论推导值68 kD相符。且超声裂解后的产物电泳结果显示:嗜水气单胞菌能在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,且均是以非天然的包涵体形式出现。 2嗜水气单胞菌溶血素A片段体外重组表达蛋白的纯化及其免疫学特性 确定了重组表达菌表达的包涵体样品用2M的尿素洗涤,再经8M尿素进行溶解处理效果较好。按照His·Bind蛋白纯化试剂盒纯化融合蛋白,取得了满意的效果。Western-blot试剂盒检测纯化蛋白结果说明:经外源表达的重组溶血素能被鼠抗溶血素血清抗体识别,重组菌表达的溶血素能作为抗原刺激小鼠产生特异性的抗体,为溶血素C片段的研究奠定了良好的基础,重组溶血素的大量纯化和抗体的大量制备有利于嗜水气单胞菌溶血素的深入研究。……   
[关键词]:嗜水气单胞菌溶血素A片段;溶血素;表达;免疫学特性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:扬州大学2007年