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禽呼肠孤病毒非结构蛋白的克隆表达及重组蛋白ELISA方法的建立

秦春香

   根据GenBank上的禽呼肠病毒(ARV)S1基因序列,设计并合成了一对跨越P10和P17非结构蛋白基因的特异性引物,对13个ARV毒株进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定。结果显示,13个ARV毒株的P10蛋白基因ORF全长均为297bp,编码98个氨基酸;P17蛋白基因ORF全长为441bp,编码146个氨基酸。这13个ARV毒株P10、P17蛋白基因核苷酸同源性分别在96.6%~100%和98.2%~100%之间,推导的氨基酸同源性分别在91.9%~99.0%和95.2%~99.3%之间。将这13个ARV毒株与GenBank上其他正呼肠病毒毒株,包括番鸭株(DRV)和飞狐上分离的内尔森海湾病毒(NelsonBayvirus,NBV)及两个澳洲分离株(ARM21和SOM24)进行同源性比较和遗传进化树分析,结果表明,呼肠病毒有地域和种类的差别。 对ARV S1133株的P17非结构蛋白基因完整ORF进行RT-PCR扩增、与PGEX-4T-I原核表达载体连接,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经0.2mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明,表达的融合蛋白分子量为42.4kD,占全菌蛋白的34%。Western-blotting结果表明:原核表达的P17重组蛋白具有抗原性,能与活病毒感染的ARV阳性血清反应。 另外,诱导表达了ARV的两个结构蛋白δ_3和δ_2以及两个非结构蛋白δNS和P17,分别用不同浓度的尿素和Triton X-100对这四个蛋白进行包涵体纯化,各蛋白的终浓度分别为:38mg/mL、48mg/mL、28mg/mL、46mg/mL。经BandScan4.3生物图象分析软件分析各蛋白的纯度分别是:68.6%、75.7%、84.0%和85.0%。达到较高的浓度和纯度,说明本试验探索的纯化方法能有效的纯化这些重组蛋白。 最后,将纯化的δ_3、δ_2和δNS、P17蛋白分别作为包被用抗原进行间接酶联免疫吸附试验(ELISA),确定其最佳包被浓度分别为9.5μg/mL、12.0μg/mL和9.3μg/mL、11.5μg/mL;一抗稀释度均为1∶200;HRP酶标羊抗鸡IgG稀释度为1∶5000,四种重组蛋白均不与NDV、AI和IBDV阳性血清发生交叉反应,具有较好的特异性。本研究初步建立了能检测ARV抗体的δ_3-ELISA、δ_2-ELISA方法,以及δ_3、δ_2两个蛋白同时包被的δ_3-δ_2ELISA方法。用这三种方法对ARV活病毒感染和灭活疫苗免疫鸡的血清进行检测,表明δ_3-δ_2-ELISA方法在ARV抗体检测方面具有较高的敏感性。用相同的方法建立了能鉴别ARV灭活疫苗免疫和活病毒感染的δNS-ELISA和P17-ELISA方法,以及δNS、P17两个蛋白同时包被的δNS-P17-ELISA方法,并对这三种方法进行敏感性比较及统计学分析,结果表明两个非结构蛋白同时包被的ELISA方法比单个抗原包被的方法能更好的区分ARV灭活疫苗免疫与活病毒感染。……   
[关键词]:禽呼肠孤病毒;序列分析;非结构蛋白;蛋白纯化;PGEX-4T-1;原核表达;酶联免疫吸附试验
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:广西大学2007年