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芽孢杆菌的生防菌株筛选及其抑病机理

连玲丽

   本研究从感染根结线虫的番茄根系中分离到46个细菌菌株,NA平板初筛获得13个抑制青枯雷尔氏菌生长的拮抗菌株,其抑菌圈宽度达7.1~26.3 mm,同时测得其中12个菌株对多种植物病原真菌有不同程度的抑制作用。温室试验表明,菌株EN5、EN15、EN01和EN16对青枯病的抑病效果最为显著,平均防效分别为70.82%、89.54%、85.38%和78.81%;而EN5、SW1和SB2能有效降低番茄根结线虫病的根结指数,抑病效果均达49%。同时测定了这些菌株对青枯病菌—根结线虫复合病的防治效果,结果表明,EN5、SW1和SB2能显著降低复合病害的病情指数,其中SW1的防效最佳,青枯病指数比对照下降56.66,根结指数降低5.21。自然土中重复测定EN5等7个菌株对青枯病和复合病害的抑病作用,其中菌株EN5、EN16、SW1和SB1的抑病效果较为稳定。通过形态和生理生化特征初步鉴定,菌株EN5、EN15、EN01、SB1、SB2和SW1等6个菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),而EN16为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus);16S rDNA序列分析进一步确定菌株EN5为枯草芽孢杆菌内生亚种(B.subtilis subsp.endophyticus)。 对菌株EN5、EN16、SW1和SB1防治番茄青枯病的作用机理进行分析,结果表明,菌株EN5处理番茄后20d,在番茄根茎部有较高定殖量(达3.60×10~4cfu/g·FW),该菌株胞外液无抗菌活性,其抑病效果仅13.56%,菌体抑病效果则高达71.19%,因此推断其作用机理是以菌体的定殖竞争作用为主;菌株SB1胞外液的抗菌活性相当显著,其抑病效果达50.85%,而定殖力明显弱于其他三个供试菌株,诱导试验中防效较差,由此推测其抑病作用主要依赖于胞外液的抗菌活性;SW1和EN16胞外液的抑病效果分别为22.03%和27.12%,远低于其菌体的抑病作用,同时两菌株具有较好的定殖力,说明抑病作用与其菌体的定殖力有关,此外,诱导抗性试验表明两菌株能有效地诱导番茄抗青枯病,诱发过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等抗病相关性酶活性的显著增强,因此,诱导抗性是它们的主要抑病机制之一。 以电镜观察法进一步分析菌株EN5在番茄根茎组织中的分布,结果显示,EN5主要分布于主根基部及茎部的韧皮组织、细胞间隙等部位。盆栽试验分析EN5菌株在不同土壤条件、不同接种方式及不同作物中的定殖力,结果表明,菌株EN5在自然土和灭菌土条件下均能稳定地定殖于番茄植株;浸种、浸根和灌根处理条件下,以灌根法的定殖效果最佳;在番茄、烟草和黄瓜体内均可定殖,其中在番茄和烟草体内的定殖量较大。菌株EN5对番茄体内及土壤中微生物种群影响的测定结果表明,EN5处理后,植株内3类主要微生物种群数量明显减少,而土壤中微生物种群在处理初期有所减少,处理后期则多数微生物群体,尤其是氨化细菌、固氮菌等生理微生物群体数量显著增多,此外,ERIC-PCR结果也表明,EN5的处理还对根围土中微生物的种类产生一定的影响。 菌株EN16和SW1灌根处理后2~10 d内挑战接种青枯病菌,均能有效诱导番茄对青枯病的抗性,其中以间隔期为7~10d诱导效果最好,与此结果相符的是,POD、PPO和PAL的酶活力在7~10d时也达到较高值。以灌根和浸种法接种菌株EN16和SW1,灌根处理可有效诱导番茄产生抗病性,浸种处理诱导效果较差。盆试测定菌株SW1和EN16对烟草花叶病毒病的诱导效果,结果表明,菌株SW1的诱导效果优于菌株EN16;病程相关蛋白结果进一步说明菌株SW1可以诱导烟草叶片中多种PR蛋白的大量积累,其诱导蛋白谱与乙酰水杨酸的有较大一致性,而EN16诱导后PR蛋白积累量较小,与乙酰水杨酸的不完全相同。 诱变试验表明,菌株SB1的抑病作用与其胞外液的活性呈正相关性。为了提高胞外活性物质的产量,对多种培养基进行筛选,结果表明,葡萄糖和矿物质可以促进活性物质的分泌。对抗菌物质理化性质的分析表明,SB1分泌的抗菌物质对热稳定、对紫外线和蛋白酶有较好的耐受力,具有水溶性和脂溶性特点。采用柱层析和高效液相技术,分离并鉴定了PD培养上清液中的抗菌成分为表面活性素,PCR技术检测SB1菌株中的抗菌素基因,结果表明,SB1菌株中的表面活性素合成基因srfA与报道序列(BACSRFAB)同源性达98%,菌株中伊枯草菌素合成基因ituB与报道的伊枯草菌素A的序列(AB050629)同源性达97.2%。进一步用电镜观察、紫外光谱扫描和SDS-PAGE分析SB1菌株抗菌成分对青枯病菌的拮抗机理,结果显示,处理后细菌胞质浓缩,细胞裂解,DNA呈现明显的增色效应,同时胞内和胞外蛋白质的表达量均受到了影响。 以含有抗菌素基因的质粒为模板,PCR合成表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和抗菌蛋白TasA的地高辛标记探针,采用斑点杂交技术对24个菌株的相关基因加以检测,并用竞争ELISA法分析阳性样品中表面活性素基因的表达情况。结果表明,以阳性质粒为模板,获得1200 bp、1479 bp和790 bp的3个特异性探针,其检测灵敏度分别为2、20和0.1 ng;从24个菌株中检测到10份样品含有表面活性素合成相关基因,10份样品含有伊枯草菌素合成相关基因和4份样品中存在tasA基因;ELISA结果表明,从10份阳性样本的KMB发酵液中均检测到表面活性素,其中菌株EN1和SB1的产量较高,达32.9 mg/L和41.0 mg/L。……   
[关键词]:芽孢杆菌;青枯病;诱导抗性;拮抗作用
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:福建农林大学2007年