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致病性迟缓爱德华氏菌PCR检测体系的建立及其mukF毒力基因的克隆表达

江云

   仅在致病性迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)国外分离株中发现的毒力基因有7种,分别为orfA、citC、fimA、gadB、katB、mukF、esrB,其中orfA基因的序列未提交,故无法根据序列设计引物。本试验确定了另外6个毒力基因在国内分离株中的分布情况,筛选出可用于检测致病性迟缓爱德华氏菌的毒力基因,最终建立致病性迟缓爱德华氏菌的PCR检测体系。根据这6个毒力基因序列,设计了6对引物,经扩增结果如下:citC、fimA、gadB和mukF均出现与目的基因大小一致的条带,经测序验证为目的条带;katB和esrB未扩增出目的条带。为了进一步验证没有扩增出katB和esrB基因是否引物问题,引用相关文献上katB和esrB基因引物和反应体系条件再次扩增,也未出现相应条带。试验结果显示:在citC、fimA、gadB和mukF这4个毒力基因特异性试验中,其它常见致病菌没有扩增出与目的基因片段大小相近的条带,引物特异性良好。各毒力基因单重PCR的灵敏度结果:gadB基因可检测到模板浓度为100fg/μL,其余3个毒力基因均可检测到的模板浓度为10pg/μL;二重PCR灵敏度试验结果表明:与单重PCR的灵敏度一致,fimA/gadB灵敏度略优于citC/mukF。毒力基因在国外分离株中和13株国内分离株中的分布情况存在差异:gadB和mukF在已经检测的国内分离株中均出现,其余的出现情况分别为:fimA基因出现在其中的8株,citC基因出现在其中的7株。从引物灵敏度试验、特异性试验以及毒力基因在国内分离株的分布情况三方面综合考虑,最终选用fimA/gadB二重PCR体系作为致病性迟缓爱德华氏菌的检测体系。迟缓爱德华氏菌检测体系的建立对于包括鳗鱼在内的水产疾病的诊断、防治有着重要的实际意义。 mukF基因是迟缓爱德华氏菌重要的毒力基因,其功能为杀伤作用,由此克隆表达mukF毒力基因,并籍此制备抗原疫苗,有助于预防迟缓爱德华氏菌引起的水产养殖动物爱德华氏菌病。本试验根据已发表的迟缓爱德华氏菌mukF毒力基因序列(AY078510),设计引物并扩增出540bp大小的片段,定向克隆至克隆载体pblue,酶切鉴定后进行序列测定和分析。结果表明:与国外参考株(AY078510)同源性达到87.8%,分析推导其核苷酸编码的氨基酸序列显示:氨基酸其同源性为93.3%,其编码180个氨基酸,共有12个氨基酸发生变化,且基本均匀分布于序列中间。将其与pET30a(+)载体构建重组质粒成功转化了BL21工程菌株,经SDS-PAGE分析表明:29KD附近出现一条明显的蛋白带,是pET30a(+)载体上编码的约8KD的蛋白与mukF基因编码的21KD的蛋白连接后形成的融合蛋白。融合蛋白表达的最佳条件为0.05mmol/LIPTG、诱导5h。mukF基因的克隆表达为在单因子水平上研究迟缓爱德华氏菌毒力、致病机理以及疫苗的制备奠定了基础。……   
[关键词]:致病性迟缓爱德华氏菌;毒力基因;PCR检测;mukF毒力基因;克隆表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:福建农林大学2007年