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效应物对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影响

陈宏惠

   以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)内脏为材料,通过0.01mol·L~(-1) Tris-HCI缓冲液(pH 7.5含0.2mol·L~(-1) NaCl,5%乙醇)抽提处理,硫酸铵分级盐析、DEAE-Cellulose(DEAE-32)离子交换柱、Sephadex G-100分子筛、第二次DEAE-32离子交换柱3次层析纯化,获得比活力为4490.79U/mg的电泳单一纯N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC3.2.1.52)。该酶亚基分子量分别为121.21、98.63和73.48 kD,等电点为4.5。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物,测得该酶在0.2mol·L~(-1)磷酸缓冲液(pH5.6)中催化水解pNP-NAG的最适pH为5.5,最适温度为45℃;该酶在低于45℃,pH 4.9-9.3范围内稳定。在pH5.6的条件下,酶水解pNP-NAG的米氏常数K_m为0.357mmol·L~(-1),最大反应速度V_(max)为10.409umol·L~(-1)·min~(-1),反应的活化能为76.50KJ/mol。 研究几种有机溶剂对该酶活力的影响。结果表明:甲醇和乙醇对酶有先扬后抑作用,正丙醇、异丙醇、甲醛、丙酮、苯酚和二甲亚砜对酶的活性均有不同程度的抑制作用。甲醇、乙醇和异丙醇对酶的抑制类型都为可逆竞争性抑制类型,它们对酶的抑制常数K_I分别为3.66mol·L~(-1)、0.36mol·L~(-1)和0.48mmol·L~(-1)。甲醛、苯酚和二甲亚砜对酶的抑制类型属于可逆非竞争性抑制类型,它们对酶的抑制常数K_I分别为0.288mol·L~(-1)、0.268mmol·L~(-1)和0.276 mol·L~(-1)。正丙醇、丙酮对酶的抑制类型为可逆混合型抑制类型,正丙醇对酶的抑制常数K_I与K_(IS)分别为3.14mmol·L~(-1)和9.35mmol·L~(-1),丙酮对酶的抑制常数K_I与K_(IS)分别为0.195mol·L~(-1)和0.620 mol·L~(-1)。戊二醛对酶活力没有影响。 研究金属离子对该酶的影响,结果表明:Na~+对酶有激活作用,Ba~(2+)、Ag~+对酶活力有先扬后抑作用。Li~+和K~+对酶有微弱的抑制作用,Mg~(2+)、Cu~(2+)、pb~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)和Al~(3+)对酶活力有不同程度的抑制作用。Mg~(2+)、Cu~(2+)和Zn~(2+)对酶的抑制均表现为可逆非竞争性抑制类型,它们对酶的抑制常数K_I分别为0.704mol·L~(-1)、1.25mmol·L~(-1)和8.10mmol·L~(-1)。Ag~+对酶的抑制作用为可逆反竞争性抑制类型,Ag~+对结合酶(ES)的抑制常数K_I为204.508mmol·L~(-1)。pb~(2+)对酶的抑制表现为可逆混合型抑制,pb~(2+)对酶的抑制常数K_I与K_(IS)分别为10.44mmol·L~(-1)和2.217mol·L~(-1)。Ca~(2+)对酶活力没有显著影响。 研究12种氨基酸对该酶的影响。结果表明:在特定浓度范围内,L-Gly、L-Val、L-Thr、L-Ala、L-Phe和L-Ser等氨基酸对酶活力没有显著影响,而L-Gln、L-Met、L-Pro、L-Arg、L-His和L-Lys对河蟹NAGase有不同程度的抑制作用。L-Pro对酶的抑制表现为可逆非竞争性类型,L-Pro对酶的抑制常数K_I为702.87mmol·L~(-1)。L-Arg、L-His和L-Lys对酶的抑制均表现为可逆反竞争性类型,它们对酶的抑制分别为1.682mmol·L~(-1)、85.81mmol·L~(-1)和1.517mmol·L~(-1)。 水体中的富营养化产生的SO_3~(2-)对该酶活力有抑制作用,抑制类型为可逆反竞争性类型,50_3~(2-)对酶的抑制常数K_I为253.995mmol·L~(-1)。NO_2~-在0-10mmol·L~(-1)范围内对酶活力有激活作用。 研究过氧化氢对该酶的影响,结果表明,过氧化氢对酶有抑制作用,抑制类型为可逆反竞争性类型,过氧化氢对结合酶(Es)的抑制常数K_I为136.78mmol·L~(-1)。 研究尿素对酶的影响,结果表明,尿素对酶活力有抑制作用,尿素对酶的抑制属于可逆混合型抑制类型,尿素对酶的抑制常数K_I与K_(IS)分别为379.02mmol·L~_(-1)和1.182mol·L~(-1)。……   
[关键词]:中华绒螯蟹;N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶;分离纯化;性质;效应物
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:福建农林大学2007年