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SDS-PAGE等三种方法对产气荚膜梭菌的比较鉴定及类毒素疫苗的初步研究

于晓霞

   产气荚膜梭菌所引起的猝死症,发病急,死亡快,因此,对疫区流行的产气荚膜梭菌的毒素型及时准确地做出判断是非常必要的。本研究详细介绍了SDS-PAGE的检测方法,并采用该方法对产气荚膜梭菌标准株、德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌20株分离株和山东省部分地区分离到的57株产气荚膜梭菌进行毒素型的鉴定,并对不同检测方法的鉴定结果进行了比较,结果SDS-PAGE与ELISA的符合率为95%,与多重PCR的符合率为100%。与此同时,SDS-PAGE方法鉴定的过程中提取了大量的外毒素,灭活后制备类毒素疫苗有针对性控制该病的流行和发生。另外,对产气荚膜梭菌外毒素的致病性也进行了初步研究。 本研究共分为五个部分: 第一部分:产气荚膜梭菌的分离和初步鉴定对山东省不同地区采集的样品通过纯分离培养,需氧及厌氧环境的对照培养,形态观察,API-20A系统生化试验,牛乳爆裂发酵试验,毒素检查对采集样品进行了分离和初步鉴定。结果,从298个样品中最终分离出57株产气荚膜梭菌。 第二部分:产气荚膜梭菌外毒素纯化过程中硫酸铵沉淀法的改进本试验采用不同饱和度的硫酸铵对产气荚膜梭菌外毒素蛋白进行盐析,并对粗提的蛋白进行电泳,通过电泳后的毒素蛋白条带及蛋白含量,最终确定60%饱和度的硫酸铵可以有效的沉淀产气荚膜梭菌外毒素蛋白。 第三部分:SDS-PAGE方法鉴定产气荚膜梭菌的毒素型产气荚膜梭菌标准株NTCC Type B 6121,德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株20株和实验一分离的57株产气荚膜梭菌除菌后,分别以60%和40%饱和度的硫酸铵溶液进行两次盐析。所得沉淀溶解后先经透析脱盐处理,再经SephadexG–200层析,并通过琼脂扩散试验检测层析液的毒素免疫活性。将含有毒素活性的层析液合并浓缩后即得到较纯的毒素。结果,经SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定出德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株20株中A型16株、C型3株和D型1株;山东地区分离株57株均为A型。 第四部分:Multi-PCR和ELISA对产气荚膜梭菌毒素型别的检测通过分别采用ELISA、多重PCR和SDS-PAGE方法对德国牛舍气源性产气荚膜梭菌分离株和山东省分离株进行型别研究,比较鉴定的结果,SDS-PAGE和ELISA方法检测结果的符合率为95%,与多重PCR方法检测结果的符合率为100%。结果表明SDS-PAGE方法与ELISA方法对产气荚膜梭菌的检测结果有一定的差异性,与多重PCR方法的检测结果一致。 第五部分:产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备及外毒素致病性的研究 产气荚膜梭菌标准株和分离株接种营养肉汤进行增菌培养,然后再接种Gordon汤,43℃厌氧振荡培养6~7h。所得培养物经低温高速离心后,上清液即为产气荚膜梭菌粗制外毒素。经测定其对小白鼠的LD50分别为0.00316和0.001。该外毒素用0.3%甲醛,分别灭活8h、16h、32h、64h、128h,加入铝胶佐剂浓缩制得产气荚膜梭菌类毒素疫苗。对该疫苗分别进行了安全性检验、免疫效力试验。结果表明用0.3%甲醛灭活32h可将产气荚膜梭菌外毒素完全灭活,制备的类毒素疫苗安全性高。对致病性的研究主要包括致死性试验、坏死性试验、致病性试验和半数致死量的测定和病理组织检查等。……   
[关键词]:产气荚膜梭菌;SDS-PAGE;毒素型鉴定
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2007年