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武夷菌素发酵条件的优化及效价的测定

王立东

   武夷菌素是从不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus.var.wuyiensis)发酵产物中提取研制出的一种具有广谱抗菌作用的农用抗生素,对多种作物病原真菌有较强抑制作用。为了提高链霉菌产生武夷菌素的效价,本研究对不吸水链霉菌的培养条件和发酵培养基进行优化,并建立了高效液相色谱法测定发酵液中武夷菌素含量的技术。 1对不吸水链霉菌产生武夷菌素原有的最佳发酵条件进行了验证和改进:发酵起始pH值为8.0,温度为25~28℃,使用菌种的种龄为18~24h,这与之前采用的发酵条件相近。发酵时间由原来的48h延长到64h。采用原有的培养基配方进行检验,使用原来条件和优化后条件发酵,武夷菌素的效价分别为3515μg/mL和4443μg/mL,可以提高26.4%。 2.首先应用替代法筛选出淀粉、葡萄糖、玉米粉、豆饼粉、化合物A、B和C、MgSO_4、FeSO_4、NaCl为武夷菌素发酵较适宜的碳、氮源和微量元素。然后应用部分因子设计法对以上10种营养成份进行了分析,确定葡萄糖和豆饼粉为影响武夷菌素效价的关键因子,最后通过最陡爬坡实验逼进最大响应区域,用中心组合设计法优化葡萄塘(x_2)豆饼粉(x_4)的浓度,得到武夷菌素效价(y)的二次多项式优化拟合模型,其为:y=6643.78+687.42x_2+275.13x_4-824.69x_2~2-122.45x_2x_4-620.94x_4~2(R=0.8999,P<0.01)。 由该模型求解可知,当葡萄糖27.2g/L、豆饼粉31.8g/L时武夷菌素效价(y)有最大值。于是按这两种关键因子的用量配制出优化培养基,用菌株S-40(原始效价4443μg/mL)比较试验测定表明,在这种优化的培养基上武夷菌素的效价可提高到6643μg/mL,即提高约50% 3.将配置好的武夷菌素标准品样品,在200~400nm吸收波长范围内用紫外扫描仪扫描,发现最大吸收峰在254nm。在进样量20μL,流速1.0mL/min和柱温25℃条件下,先后以纯水、乙腈、三氟乙酸、乙酸铵和三氯乙酸的水溶液为流动相进行分离,发现当三氯乙酸在1.4g/L时(pH~-2.0)效果最好。考虑到pH对色谱柱的影响,纯水流动相引起色谱柱塌陷问题以及填料直径对色谱柱分离效果的影响,最终选择了填料直径为5μm耐酸(1<pH<12)和耐纯水的ZORBAX SB-AQ(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱。将色谱峰面积与武夷菌素浓度进行线性回归得到的经验方程为:y=0.272+0.345x(R=0.9994,P<0.01),这表明在0.2mg/mL~1.6mg/mL浓度范围内线性关系良好,变异系数为0.43%~2.08%,回收率为96.59%~100.57%,于是建立了应用高效液相色谱法检测武夷菌素有效成份的技术。 利用管碟法中的“一剂量法”进行武夷菌素效价标准曲线绘制。以不同浓度武夷菌素抑菌圈直径为横坐标,浓度的常用对数值为纵坐标,绘制武夷菌素效价标准曲线,求得回归方程y=-1.5097+0.1199x(R=0.9948,P<0.01)。结果表明武夷菌素在20μg/mL~60μg/mL浓度范围内抑菌圈直径与浓度的对数呈直线关系。 同时通过试验测定和分析,建立了管碟法与HPLC法测定的武夷菌素含量之间的多元线性模型,并对模型进行了验证。管蝶法测定的武夷菌素生物效价(y)与用HPLC测得的武夷菌素A、B、C、D组分峰面积之间的多元线性模型为: y=1025.041-0.375A+3.997B-1.072C+0.220D(R=0.9958,P<0.01)……   
[关键词]:武夷菌素;不吸水链霉菌;培养条件优化;效价测定;高效液相色谱
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西南大学2007年