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共振瑞利散射技术在博莱霉素类抗肿瘤药物分析中的应用研究

刘江涛

   共振Rayleigh散射技术是二十世纪九十年代发展起来的一种分析技术,由于其在研究生色团与生物大分子的聚集作用以及具有相反电荷的离子之间的离子缔合作用时显示出高的灵敏度和选择性,特别是对于生物大分子的一些非键合作用特别敏感,而成为生物大分子的测定和表征的一种非常有用的技术,在核酸的研究和测定中也显示出它的优越性。 随着分子生物学的发展,在分子水平上研究小分子和生物大分子的作用方式引起了人们的广泛重视,其中研究抗癌药物与DNA的结合反应是一个非常活跃的领域,它不仅有助于了解抗癌药物的作用机理,同时也能为合成新型的抗癌药物提供有用的信息。因此,本文利用共振瑞利散射技术研究博莱霉素类抗肿瘤药物与核酸和蛋白质等生物大分子的反应,建立了以抗癌药物作探针,共振瑞利散射法测定生物大分子的高灵敏的分析方法;并对RRS法在博莱霉素类抗肿瘤药物测定中的应用进行了研究。本文的主要研究内容及成果如下: 一、平阳霉素及其金属配合物与核酸相互作用的共振瑞利散射光谱及其分析应用研究 1、盐酸平阳霉素与核酸反应的共振瑞利散射光谱及其分析应用研究 用共振Rayleigh散射(RRS)并结合吸收光谱和荧光光谱研究了盐酸平阳霉素(BLMA_5)与核酸的相互作用。结果表明,在PH2.2左右的酸性介质中,BLMA_5能够和核酸结合形成复合物引起RRS显著增强,具有特征吸收波长红移和吸收增强效应,并能观察到BLMA_5的荧光猝灭。不同核酸的RRS光谱特征略有差异,最大散射波长分别位于301nm(ctDNA和sDNA)、370nm(hsDNA)和310nm(RNAtypeⅢ和RNAtypeⅥ),散射增强的程度各不相同,其中DNA的增强程度比RNA大。考察了BLMA_5和核酸反应的最佳反应条件及影响因素,并对BLMA_5与核酸的嵌入结合模式进行了讨论。建立了一种用BLMA_5作探针RRS法测定DNA的高灵敏度、简单、快捷的分析方法。该方法的检出限(3σ)分别为5.7ngmL~(-1)(ctDNA),7.4ng mL~(-1)(sDNA),9.2 ng mL~(-1)(hsDNA),用于合成样品及质粒DNA样品的测定,获得满意效果。 2、博莱霉素二价铜和二价铁配合物与核酸反应的吸收、荧光和共振瑞利散射光谱研究 以核酸作为研究对象,研究了博莱霉素(BLMA_2)金属配合物的形成及与核酸反应的吸收、荧光和RRS光谱特征,结果表明,在一定的酸度条件下BLMA_2能够与Fe(Ⅱ),Cu(Ⅱ)形成金属配合物,引起博莱霉素吸收光谱的变化和荧光猝灭。当金属配合物进一步与核酸作用形成三元离子缔合物时,引起共振瑞利散射强度(RRS)显著增强,不同的金属配合物与核酸作用形成结合产物的RRS光谱特征相似,最大RRS峰均位于301nm附近,但其RRS增强的程度有较大差异,其中Cu(Ⅱ)>Fe(Ⅱ),本文讨论了酸度对博莱霉素金属配合物的形成及其与核酸形成三元离子缔合物的影响,探讨了离子缔合物的形成对博莱霉素吸收光谱、荧光光谱和RRS光谱的影响,以Cu(Ⅱ)-BLMA_2为例,建立了用博莱霉素金属配合物作探针RRS法测定DNA的高灵敏度的分析方法。该方法的检出限(3σ)分别为7.2 ng mL~(-1)(ctDNA),7.05 ng mL~(-1)(sDNA)和18.3 ng mL~(-1)(hsDNA)。 二、博莱霉素类抗肿瘤药物与卤代荧光素染料反应的吸收、荧光及共振瑞利散射光谱研究及其分析应用 研究了赤藓红(Ery),曙红Y(EY),曙红B(EB)和虎红(R8)四种卤代荧光素染料与BLMA_5和BLMA_2的相互作用。结果表明,它们均能和博莱霉素抗肿瘤药物结合形成离子缔合物,引起染料的吸收减弱,荧光猝灭,共振瑞利散射强度大大增强,其吸光度降低的程度(ΔA),荧光猝灭程度(ΔF)以及RRS增强的程度(ΔI_(RRS))均与博莱霉素类抗生素的浓度成正比,反应具有高灵敏度。据此,建立了褪色分光光度法、荧光猝灭法和RRS法三种测定博莱霉素抗肿瘤药物的新方法,这三种方法的灵敏度均比一般的分光光度法和荧光法要高,其中RRS的灵敏度最高,对于BLMA_5的检出限(3σ)为16.6ng mL~(-1),BLMA_2的检出限(3σ)为18.0 ng mL~(-1),讨论了适宜的反应条件,结合量子化学计算,对离子缔合物的组成,反应产物对吸收、荧光和RRS的影响及其原因进行了探讨。 三、博莱霉素金属配合物与蛋白质及其某些染料小分子反应的共振瑞利散射光谱及其分析应用研究 1、Cu(Ⅱ)-平阳霉素-蛋白质体系的共振瑞利散射光谱研究 Cu(Ⅱ)-BLMA_5配合物在适宜条件下在蛋白质表面聚集,形成新型超分子化合物。散射粒子的增大及体系的疏水性提高增强了共振瑞利散射信号。牛血清白蛋白和人血清白蛋白的最大散射波长均位于550nm附近,散射增强的程度BSA大于HSA,它们的线性范围分别为0.095~15μg mL~(-1)(BSA)和0.16~15μg mL~(-1)(HSA),检测限分别为0.028μg mL~(-1)(BSA)和0.048μg mL~(-1)(HSA),人血清中蛋白质的含量测定结果与考马斯亮蓝法接近。 2、盐酸平阳霉素金属配合物与赤藓红反应的共振瑞利散射光谱研究 在pH4.0左右的BR介质中,研究了盐酸平阳霉素与金属离子Cu(Ⅱ)和Co(Ⅱ)形成的阳离子配合物和阴离子染料赤鲜红结合生成三元离子缔合物的反应,结果表明,三元离子缔合物的形成使体系的共振瑞利散射强度(RRS)显著增强,两个金属离子所形成的结合产物的RRS光谱特征相似,最大RRS峰均位于287nm附近。但引起的RRS增强的程度Co(Ⅱ)>Cu(Ⅱ),RRS的增量与平阳霉素的浓度在一定范围内线性相关,据此建立了一种测定平阳霉素的高灵敏度的分析方法。该方法的检出限(3σ)分别为14.4 ngmL~(-1)(Co(Ⅱ)-BLMA_5),19.8 ngmL~(-1)(Cu(Ⅱ)-BLMA_5),和前面讨论的二元体系相比,扩大了测定的线性范围。 3、Ce(Ⅳ)-平阳霉素-刚果红体系的共振瑞利散射光谱研究 研究了Ce(Ⅳ)-盐酸平阳霉素-刚果红体系的共振瑞利散射光谱特征,结果表明,在pH 5.4的HAc-NaAc缓冲溶液中,平阳霉素(BLMA_5)能够与Ce(Ⅳ)形成四价的配合阳离子进而与刚果红的阴离子借助静电引力和疏水作用形成三元离子缔合物,使共振瑞利散射强度明显增强。基于此,建立了测定平阳霉素抗生素的共振瑞利散射(RRS)法,并对其光谱特征、影响因素、适宜的反应条件和共存物质的影响以及反应机理作了讨论。对BLMA_5的检出限为0.15μg.mL~(-1),线性范围0.51~10μg.mL~(-1),为研究稀土元素和博莱霉素的反应提供了一种新的方法。……   
[关键词]:共振瑞利散射;博莱霉素;博莱霉素金属配合物;核酸;蛋白质
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西南大学2007年