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人胰岛素样生长因子I(hIGF-I)前体基因的重组、表达及其蛋白纯化

施有为

   目的:IGF-Ⅰ诊断试剂盒目前在国际上只有美国、德国等几个国家生产,且价格极其昂贵,导致在国内临床上的应用大大受限。本室验室曾选用多种载体制备IGF-Ⅰ蛋白抗原,但效果不理想,蛋白得率均比较低,给进一步制备IGF-Ⅰ单克隆抗体及生产IGF-Ⅰ诊断试剂盒带来困难。为填补国内IGF-Ⅰ诊断试剂盒自主生产的空白,本实验在既往实验研究的基础上,选用pET32a(+)载体构建含有人胰岛素样生长因子1(human Insulin-like Growth Factor-1,hIGF-Ⅰ)前体编码全长cDNA的重组载体,使其在E.coli BL21(DE3)中表达,并对此表达菌株所表达的重组靶蛋白进行纯化,同时探讨其抗原性及单抗制备中的应用价值。 方法:1.采用PCR法,扩增编码hIGF-Ⅰ前体cDNA的片段,通过双酶切、胶回收纯化、连接后得到pET32a(+)/hIGF-Ⅰ重组载体。2.将其转化入BL21(DE3)中,经IPTG诱导后表达的重组蛋白经镍柱亲和层析纯化。3.用western blot法检测重组蛋白的抗原活性。 结果:重组质粒pET32a(+)/hIGF-Ⅰ经双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。BL21(DE3)表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后显示其表达量占细菌总蛋白量的25%左右,该重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后其纯度高达90%以上。western blot结果显示非常清晰的免疫印迹条带,表明此重组蛋白具有免疫学特异性。 结论:pET32a(+)/hIGF-Ⅰ重组载体构建成功,并能够高效表达具有免疫学特性的hIGF-Ⅰ前体蛋白,为进一步制备IGF-Ⅰ单克隆抗体及生产IGF-Ⅰ诊断试剂盒打下了良好基础。……   
[关键词]:人胰岛素样生长因子-1前体;PCR;重组蛋白;亲和层析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京医科大学2007年